Анализ in vivo для корреляции бактериальной биолюминесценции с плотностью клеток

Аннотация

Источник: Brodl, E., et al. Измерение in situ и корреляция плотности клеток и светового излучения биолюминесцентных бактерий. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео показано измерение и корреляция биолюминесценции с плотностью клеток у трансформированных бактерий. Одна колония бактерий используется для инициации жидкой культуры. Культуру помещают в лунку при нужной концентрации клеток. Антибиотик и индуктор добавляются для экспрессии гена, необходимого для бактериальной биолюминесценции. Показания абсорбции и биолюминесценции снимаются через равные промежутки времени с помощью планшетного ридера.

Протокол

1. Дизайн, приготовление и выражение люксового оперона в Escherichia coli

Примечание: Смотрите Таблицу материалов для получения информации о коммерческих наборах, используемых в этом разделе.

1. Для переноса lux-оперона в E. coli выбирают стандартный вектор pET с соответствующими сайтами рестрикции и интересующим геном антибиотикорезистентности (например, pET28a; NcoI, XhoI, канамицин).
2. Спроектируйте фрагменты и перекрывающиеся праймеры для сборки Gibson на основе последовательности ДНК Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
3. Организуйте стандартную реакцию полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием разработанных праймеров и выделенной геномной ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) Photobacterium mandapamensis 27561 в качестве шаблона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение геномной ДНК соответствующего бактериального штамма повышает эффективность ПЦР.
4. Очистите продукт ПЦР с помощью очистки спин-колонкой.
5. Проводят рестрикционное расщепление выделенного вектора pET28a NcoI и XhoI при 37 °C в течение 45 мин.
6. Очистите линеаризованный вектор и фрагменты ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле и последующей очистки спин-колонкой.
7. Определите концентрацию ДНК каждого фрагмента и линеаризованного вектора, а также рассчитайте оптимальные количества для сборки в соответствии с протоколом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность сборки зависит от размера и количества фрагментов и должна быть скорректирована в соответствии с протоколом производителя.
8. После объединения всех фрагментов и буфера в пробирке для ПЦР инкубируйте сборочную смесь в машине для ПЦР при температуре 50 °C в течение 1 ч.
9. Трансформируйте собранный векторный продукт в соответствии со стандартными протоколами трансформации бактериальной плазмиды E. coli в подходящую систему E. coli для репликации плазмид с высоким выходом (например, E. coli TOP10 или XL-1).
10. Выбирайте колонии с трансформационной пластины и наносите новые пластины для выделения ДНК.
11. Изолируйте плазмидную ДНК в соответствии со стандартными протоколами.
12. Чтобы убедиться в правильности сборки плазмиды, включая все фрагменты, сначала проведите ПЦР колоний по стандартным протоколам с использованием праймеров, специфичных для каждого собранного фрагмента.
13. В дополнение к ПЦР колоний и последующему электрофорезу в агарозном геле подготовьте все изолированные сборочные векторы для секвенирования ДНК, чтобы проверить правильную сборку и правильные последовательности ДНК.
14. Преобразуйте верифицированную плазмиду в соответствии со стандартными протоколами трансформации бактериальной плазмиды E. coli в подходящую систему E. coli для производства белка с высоким выходом (например, E. coli BL21).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите непосредственно к приведенному ниже протоколу экспрессии. Для более длительного хранения рекомендуется приготовление глицеринового бульона.

2. Экспрессия модифицированных штаммов E. coli

1. Приготовьте ночную культуру (ONC) для экспрессии путем инокуляции соответствующего объема среды Лурии-Бертани (LB) (например, 100 мл) предварительно приготовленным глицериновым запасом клеток E. coli BL21, трансформированным с помощью собранной плазмиды или непосредственно из трансформационной пластины. Добавьте 100 мкл канамицина (50 мг/мл; ген устойчивости к антибиотикам pET28a) и инкубируйте ONC при 37 °C и 120 об/мин в шейкере инкубатора в течение ночи.
2. Инокулируйте основную культуру экспрессии (например, 800 мл среды LB) 8 мл ONC и добавьте 800 мкл канамицина (50 мг/мл).
3. Инкубируйте основную культуру при 37 °C и 120 об/мин в шейкере инкубатора до тех пор, пока плотность клеток не достигнет наружного диаметра₆₀₀ 0,6 - 0,8 (примерно 2,5 ч).
4. Уменьшите температуру инкубации до 28 °C.
5. Индуцировать экспрессию белка путем добавления пропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 0,1 мМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эмпирические испытания показали, что снижение температуры до 28 °C дает наивысшую интенсивность света.
6. Наблюдайте за клетками до тех пор, пока они не начнут сиять (примерно 1 ч).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от цели сцеживания, клетки выращивают до следующего дня, а затем собирают, или же клетки можно продолжать трясти до тех пор, пока они сияют (максимум 48 ч). Забор клеток и очистка любых белков может производиться в соответствии со стандартными процедурами.

3. Экспрессия бактериальных биолюминесцентных штаммов

ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальные биолюминесцентные штаммы требуют определенной питательной среды/искусственной среды морской воды для роста и производства света.

1. Приготовьте искусственную среду морской воды, состоящую из двух отдельно подготовленных компонентов среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие количества указаны для 1 л жидкой среды или 1 л агаровой среды.
   1. Для искусственной морской водной среды взвесьте следующие соли: 28,13 г NaCl (хлорид натрия), 0,77 г KCl (хлорид калия), 1,60 г CaCl₂ · 2H₂O (дигидрат хлорида кальция), 4,80 г MgCl₂ · 6H₂O (гексагидрат хлорида магния), 0,11 г NaHCO₃ (бикарбонат натрия) и 3,50 г MgSO₄ · 7H₂O (гептагидрат сульфата магния).
   2. Добавьте 1 л дистиллированной воды и растворите все компоненты.
   3. Для среды LB добавьте следующие ингредиенты: 10 г дрожжевого экстракта, 10 г пептона, а для агаровых пластин еще 20 г агара.
   4. Добавьте 250 мл водопроводной воды и растворите компоненты.
   5. Автоклав обе подготовленные среды отдельно при температуре 121 °C в течение 20 мин.
   6. Для агаровых пластин смешайте 250 мл среды LB с 750 мл искусственной среды морской воды сразу после автоклавирования и подготовьте пластины.
   7. Для жидкой среды смешайте 250 мл среды LB с 750 мл искусственной среды морской воды сразу после автоклавирования или после охлаждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Искусственная среда морской воды может мутнеть из-за осаждения соли.
2. Нанесите бактериальные биолюминесцентные штаммы на агаровые пластины искусственной морской воды и инкубируйте в течение ночи при температуре 24 - 30 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное хранение бактериальных штаммов обычно достигается путем замораживания запасов глицерина бактериальной культуры. Штаммы всегда следует наносить сначала на агаровые пластины, чтобы обеспечить одинаковые начальные условия для всех штаммов, прежде чем использовать их для жидких культур, из-за задержки в росте после оттаивания.
3. Приготовьте ONC, введя 100 мл искусственной морской водной среды в одну колонию из планшета. Инкубируйте ONC при температуре 24 - 30 °C и 120 об/мин в шейкере инкубатора в течение ночи.
4. Инокулируйте 800 мл искусственной морской водной среды 8 мл ONC.
5. Инкубируйте бактериальные клетки при температуре 24 - 30 °C и 120 об/мин в шейкере инкубатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Профиль интенсивности света биолюминесцентных бактерий сильно изменяется в зависимости от температуры. В зависимости от регуляторных механизмов светопродукции соответствующего бактериального штамма, световое излучение может начаться примерно через 1 - 6 часов.
6. Наблюдайте за бактериальными клеточными культурами до тех пор, пока они не начнут сиять (примерно 1 - 6 часов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от цели экспрессии, клетки выращивают до следующего дня, а затем собирают, или же клетки можно продолжать трясти до тех пор, пока они сияют. Забор клеток и очистка любых белков может производиться в соответствии со стандартными процедурами.

4. Анализ активности in vivo для бактериальных биолюминесцентных штаммов и модифицированных штаммов E. coli

ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное хранение штаммов обычно достигается за счет замораживания запасов глицерина бактериальной культуры. Штаммы всегда следует наносить сначала на агаровые пластины, чтобы обеспечить одинаковые начальные условия для всех штаммов, прежде чем использовать их для жидких культур, из-за задержки в росте после оттаивания.

1. Нанесите желаемый биолюминесцентный бактериальный штамм или модифицированный штамм E. coli на агаровую пластину и инкубируйте при температуре 28 °C в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура инкубации может варьироваться от штамма к штамму и должна быть оценена эмпирически. Чтобы иметь возможность сравнивать биолюминесцентные штаммы бактерий и модифицированные штаммы E. coli, условия роста должны быть идентичными.
2. Инокулируйте 3 мл среды с соответствующим штаммом с одной колонией из агаровой тарелки и инкубируйте клетки при 28 °C и 180 об/мин в шейкере инкубатора в течение примерно 1 - 2 ч.
3. Измерьте плотность клеток при разведении жидкой культуры в соотношении 1:10 при длине волны 650 нм. Рассчитайте соотношение и объем для 1 мл культуры с OD650 0,05,
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последующий анализ с помощью планшетного ридера определит плотность клеток на длине волны 650 нм, чтобы избежать интерференции световым излучением штаммов.
4. Пипеткой рассчитанный объем культуры и среды внесите в 24-луночный черностенный планшет со стеклянным дном. Для модифицированного штамма E. coli добавьте в образцы 1 мкл канамицина (антибиотикорезистентность вектора pET28a) и 1 мкл IPTG (индукция экспрессии генов). Закройте планшет крышкой, чтобы избежать испарения во время измерений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гарантировать, что вектор pET28a, содержащий весь люкс-оперон, не будет потерян культурой E. coli, необходимо добавить канамицин в каждый образец E. coli в лунках планшета и обеспечить возможность измерения световой продукции клеток E. coli. экспрессия генов должна быть индуцирована ППТГ. Чтобы избежать перекрестных помех и помех при измерениях, наилучшие результаты показали планшеты с черными стенками и стеклянными дном и прозрачными крышками. Тем не менее, перекрестные помехи могут наблюдаться, и позиции для скважин должны быть тщательно выбраны.
5. Начните измерение в планшетном ридоре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол планшетного ридера основан на специально разработанном для этого анализа скрипте, который сочетает в себе два измерения: абсорбцию и биолюминесценцию. Данные собираются каждые 10 минут с постоянным встряхиванием между измерениями и постоянной температурой 28 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs Inc.	E2621S	для 10 rxndx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
фузионной полимеразы	Thermo Scientific	F530S
Q5 High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs Inc.	M0491S
Набор для очистки геномной ДНК GeneJet	Thermo Scientific	K0721	для 50 ферментов
рестрикции rxn и буфера (NcoI, XhoI)	New England Biolabs Inc.	R3193S/R0146S
Набор для очистки гелем и ПЦР Wizard SV	Promega	A9282	для 250 rxn
Monarch DNA Gel Extraction Kit	New England Biolabs Inc.	#T1020S	для 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0503	для 250 rxn
GoTaq G2 ДНК-полимераза	Promega	M7841
24-луночный черный сенсоплят со стеклянным дном	Greiner Bio One	662892
FLUOStar Omega планшет считыватель	BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analysis Программное обеспечение	BMG Labtech		версии 2.20
Microsoft Excel 2010
Microsoft Multitron Стандартный инкубатор Shaker	Infors AG