Выращивание бактерий Magnetospirillum и оценка их магнитотаксического поведения

Аннотация

Источник: Le Nagard, L., et al. Выращивание магнитотаксических бактерий рода Magnetospirillum: штаммы MSR-1, AMB-1 и MS-1. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео показано, как культивировать бактерии Magnetospirillum в микроаэробных условиях с использованием как жидких, так и полутвердых сред. Он подчеркивает образование видимой бактериальной полосы на кислородно-бескислородной границе раздела и ее миграцию вверх по мере истощения кислорода. В видео также показано, как оценить магнитотаксическое поведение путем наблюдения за направленным плаванием в ответ на магнитное поле.

Протокол

1. Инокуляция магнитотактических бактерий (МТБ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Культуры штаммов AMB-1, MS-1 и MSR-1 могут быть получены коммерчески (Таблица материалов).

ВНИМАНИЕ: Выполняйте все следующие действия в стерильных условиях, под пламенем горелки Бунзена.

1. Инокуляция штаммов MSR-1, AMB-1 и MS-1 в жидкую среду
   1. Запечатайте пустую бутылку сыворотки объемом 125 мл с пробкой из бутилкаучука и алюминиевым обжимным уплотнением. Через пробку вставьте во флакон две иглы, а к одной из них подсоедините шприц. Подсоедините шприц к цилиндру с концентрацией Ø2 через трубку того же типа, что и трубка, используемая для станции N₂.
   2. Дайте O₂ протекать через бутылку в течение примерно 30 минут, чтобы убедиться, что весь воздух в бутылке заменен на O₂. Удалите обе иглы, допустив небольшое избыточное давление в бутылке, а затем проведите автоклав. Дайте бутылке остыть до комнатной температуры перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сэкономить время, выполните шаги 1.1.1 и 1.1.2 во время приготовления среды и автоклавируйте бутылку вместе со средой или исходными растворами.
   3. Простерилизуйте крышки пробок как бутылки со свежим материалом, так и бутылки O₂, нанеся на них несколько капель 70% раствора этанола и пропустив их через пламя горелки Бунзена.
   4. С помощью стерильного шприца и иглы извлеките 1 мл О₂ из флакона О₂ и переложите его в флакон со свежей средой. Убедитесь, что игла плотно прилегает к шприцу во время этого этапа, чтобы избежать попадания воздуха в шприц
   .
   5. При использовании инокулюма из другой культуры, выращенной в стеклянной бутылке, простерилизуйте пробки как в бутылке со свежей средой, так и в бутылке со старой культурой, нанеся на них несколько капель 70% раствора этанола и пропустив их через пламя горелки Бунзена. Если вы используете инокулят из пробирки с замороженной культурой, просто дайте ему нагреться до комнатной температуры, запечатав пробирку под пламенем горелки Бунзена.
   6. При использовании посевного материала из другой культуры, выращенной в стеклянной бутылке, внесите 1 мл более старой культуры в свежую среду. При использовании инокулята из замороженного сырья вводите только 0,1 мл для разбавления глицерина или диметилсульфоксида (ДМСО), используемого в процессе замораживания. В обоих случаях используйте стерильную иглу и стерильный шприц.
   7. Инкубируйте культуру при температуре 32 °C и инокулируйте ее в свежую среду через 4–7 дней.
2. Инокуляция MSR-1 в полутвердую среду с градиентом O₂
   1. Убедитесь, что трубка свежей среды имеет четко определенный кислородно-бескислородный интерфейс (OAI), материализованный в виде границы от розового до бесцветного.
   2. Если посевной материал получен из другой полутвердой культуры с градиентом концентрации_О2, соберите бактерии путем пипетирования 50 мкл культуры с помощью стерильного наконечника пипетки, помещенного на полосу, образованную бактериями. Медленно вводите эти бактерии в OAI в свежую среду (розовый/бесцветный интерфейс), избегая нарушения границы раздела. Если инокулюм поступает из замороженной культуры, действуйте таким же образом, добавив 100 мкл инокулюма.
   3. Закройте пробирку и дайте бактериям расти при температуре от 25 °C до 30 °C. Переложите в свежую среду по той же процедуре, прежде чем полоса бактерий достигнет поверхности среды.

2. Наблюдение за бактериями

:

1. Стерилизуйте пробку флакона с культурой, нанеся на нее 70% раствор этанола и пропустив ее через пламя горелки Бунзена. Для полутвердой среды откройте трубку под пламенем горелки Бунзена. Используйте стерильную иглу и стерильный шприц для извлечения бактерий.
2. Используйте метод висячей капли8, чтобы убедиться, что бактерии являются как магнитными, так и подвижными.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фазово-контрастная микроскопия дает отличные результаты, но не является обязательной. Подходят увеличения в диапазоне от 10Х до 60Х.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
AMB-1	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC	ATCC 31632
MSR-1	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)	DSM 6361
L-cystere.HCl.H₂O	Sigma-Aldrich	C7880-100G
1,0 мл шприцы	Fischer scientific	B309659
25G x 1 иглы	BD	305125
125 мл флаконы с сывороткой	Wheaton	223748
20 мм алюминиевые уплотнители	Wheaton	224223-01
20 мм E-Z Crimmer	Wheaton	W225303
пробки из бутилкаучука	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
Трубки Hungate	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
Пробка перегородки, 13 мм, Hungate	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
Стеклянные пробирки для культивирования	Corning (VWR)	9826-16X