Метод микроразведения бульона для определения чувствительности грамположительных бактерий к антибиотикам

Abstract

Источник: Koeth, L. M., et al., Эталонный метод микроразведения бульона для тестирования чувствительности к дальбаванцину in vitro бактерий, которые растут аэробно. J. Vis. Exp. (2015).

В данном видео показан метод микроразведения бульона для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) липогликопептидного антибиотика в отношении грамположительных бактерий. Он охватывает выделение бактериальных колоний, разведение, инокуляцию лунок микропланшетов с различными концентрациями антибиотиков, а также проверку чистоты культуры и количества клеток. В видео также объясняется, как связывание антибиотиков нарушает синтез клеточной стенки, что приводит к лизису, и как идентифицировать МПК на основе видимого ингибирования роста.

Protocol

1. Приготовьте разведения панелей MIC

1. Приготовьте исходный раствор не выше 1 600 мкг/мл далбаванцина в чистом (чистом) диметилсульфоксиде (ДМСО) в стерильных стеклянных или пластиковых пробирках и используйте в тот же день приготовления или храните при температуре от -20 до -60 °C или ниже для будущего использования в морозильной камере, не требующей размораживания. При взвешивании порошка учитывайте эффективность дальбаванцина, указанную в документации, полученной вместе с порошком.
2. Разводят поголовье по аналогии со схемой с аккуратным ДМСО в стерильных стеклянных или пластиковых пробирках. Используйте одну пипетку для измерения разбавителя, а другую — для добавления исходного запаса далбаванцина в первую пробирку. Для каждой последующей концентрации далбаванцина в запасе используют новую пипетку.
3. Приготовьте 100-кратное окончательное разведение концентраций панели MIC (промежуточные концентрации) с помощью аккуратного ДМСО. Комбинируйте соответствующие объемы источника и ДМСО для достижения желаемой промежуточной концентрации (используемые объемы будут зависеть от количества панелей MIC, которые будут изготовлены).
4. Приготовьте 0,004% P80: Приготовьте свежий раствор рабочего материала 2% P80, добавив 0,1 мл P80 к 4,9 мл dH₂O. Стерилизуйте, пропустив через фильтр 0,22 мкм, и используйте раствор в тот же день приготовления. Приготовьте 0,004% разбавитель Р80 путем разведения 2% Р80 в соотношении 1:500 (например, от 0,3 мл 2% Р80 до 149,7 мл CAMHB).
5. Кроме того, разбавьте промежуточные концентрации 1:100 в катионно-скорректированном бульоне Мюллера-Хинтона (CAMHB) с добавлением 0,004% (v/v) полисорбата-80 (P-80) и/или LHB (для стрептококков) в двойном значении конечной концентрации, поскольку добавление инокулюма приведет к разведению в соотношении 1:2.

2. Подготовка панелей MIC

:

1. Дозируйте по 50 мкл каждого приготовленного раствора дальбаванцина в соответствующие лунки панели MIC и включайте среды только в одну лунку (лунка для контроля роста). Для этого этапа можно использовать многоканальный пипетку со стерильными наконечниками.
2. Используйте панели сразу или запечатайте полиэтиленовой пленкой, поместите их в полиэтиленовые пакеты и сразу же поместите в морозильную камеру без размораживания при температуре ≤-20 °C (предпочтительно при ≤ -60 °C) до тех пор, пока это не понадобится. Если используются замороженные панели, снимите пломбы и поместите отдельные панели на лабораторный стол на 15–30 минут (пока содержимое лунки не разморозится), прежде чем приступать к модифицированию панелей.

3. Инокулируйте панели MIC, выполните очистку и настройте подсчет колоний

1. Выберите несколько хорошо изолированных колоний из 18–24-часового кровяного агара или другой неселективной агаровой пластины. Прикоснитесь к верхней части каждой колонии стерильной петлей или тампоном и перенесите на 1–5 мл CAMHB или физиологического раствора до тех пор, пока мутность не станет эквивалентной 0,5 стандарта по Фарланду. Оцените мутность путем визуального сравнения с 0,5 по шкале Макфарланда или с помощью фотометрического прибора.
2. В течение 15–30 мин после приготовления разведите посевной материал в соотношении 1:100 в CAMHB (100 мкл на 10 мл CAMHB). Для большинства бактерий, протестированных на дальбаванцин, за исключением S. pneumoniae, такое разведение обеспечит концентрацию в конечной лунке 5 × 10⁵ КОЕ/мл (допустимый диапазон составляет 2–8 × 10⁵ КОЕ/мл). Для S. pneumoniae концентрация бактерий на основе сравнения мутности с 0,5 по шкале Макфарланда, как правило, значительно ниже. Поэтому разведите инокулюм в соотношении 1:25 (400 мкл в 10 мл CAMHB + 10% LHB).
3. В течение 15 мин после получения инокулюма в каждую лунку (за исключением лунки для контроля стерильности) подготовленной панели ВПК необходимо перекачать по 50 мкл конечного инокулята. Для этого шага можно использовать многоканальный пипетку со стерильными наконечниками.
4. Проведите проверку чистоты, перенеся и распределив аликвоту объемом 1–10 мкл из лунки для контроля положительного роста с использованием стерильной петли в неселективный агар (например, триптиказный соевый агар с 5% овечьей крови).
5. Настройте количество колоний, удалив 10 мкл из лунки для контроля роста с помощью одноканальной пипетки и стерильного наконечника и переведя в 10 мл физиологического раствора (разведение 1:1000). Смешайте и перенесите 100 мкл с помощью одноканальной пипетки и стерильного наконечника в подходящую неселективную агаровую среду (например, триптиказный соевый агар с 5% овечьей крови) и распределите по всей поверхности агара с помощью стерильной петли, повторяя дважды в разных направлениях для обеспечения равномерного распределения инокулюма (разведение 1:10).

4. Инкубация панелей MIC, Colony Count и Purity Plates

1. Перед инкубацией запечатайте каждую панель MIC или стопку не более чем из четырех панелей в пластиковый пакет с пластиковой лентой или плотно прилегающей пластиковой крышкой. В качестве альтернативы поместите пустую панель MIC на верхнюю часть стопки, состоящей не более чем из 4 панелей MIC, поместите влажное бумажное полотенце в пластиковый контейнер, поместите панели MIC в пластиковый контейнер и надежно закройте контейнер крышкой. Инкубируйте панели MIC в инкубаторе с окружающим воздухом при температуре 35 °C ± 2 °C в течение 16–20 часов (стафилококки и энтерококки) и 20–24 часов (стрептококки) в течение 30 минут после посева. Инкубируйте планшеты с подсчетом колоний и чистотой в тех же условиях, за исключением инкубации стрептококков в инкубаторе с 5% содержанием CO₂.

5. Чтение таблиц ВПК и подсчета колоний; Контрольная пластина чистоты

1. Считывайте MIC как самую низкую концентрацию, которая полностью подавляет рост бактерий в лунках, обнаруженных невооруженным глазом.
2. Подсчет колоний на табличке подсчета колоний. Умножьте каждую колонию на коэффициент разбавления (1:10 000) (например, 50 колоний эквивалентны 5 × 10⁵ КОЕ/мл). Приемлемый диапазон составляет 20–80 колоний (2–8 × 10⁵ КОЕ/мл) и используется в качестве приблизительного ориентира.
3. Проверьте табличку чистоты. Если все колонии похожи на каждую колонию, то инокулят можно считать чистым. Если присутствуют какие-либо другие колонии, то существует вероятность присутствия загрязняющего вещества в панели MIC, и тест следует повторить.

Materials