Наночастице-опосредованная визуализация эндолизосомального ремоделирования в бактериально-инфицированных клетках

Аннотация

Источник: Zhang, Y., et al. Применение флуоресцентных наночастиц для изучения ремоделирования эндолизосомальной системы внутриклеточными бактериями. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео демонстрируется использование флуоресцентных наночастиц для визуализации эндолизосомального ремоделирования в эпителиальных клетках человека, инфицированных внутриклеточными бактериями. После бактериальной инвазии патогены манипулируют цитоскелетом хозяина и эндолизосомальной системой, образуя вакуоли с трубчатыми выступами, которые изменяют транспорт везикул. Флуоресцентно меченные наночастицы затем используются для отслеживания этих изменений, что позволяет с высоким разрешением визуализировать события внутриклеточного транспорта, вызванные патогенами.

Протокол

1. Культура клеток HeLa
   1. Клетки HeLa постоянно экспрессируют LAMP1-GFP (лизосом-ассоциированный мембранный гликопротеин 1-зеленый флуоресцентный белок) культивируют в модифицированной среде Dulbecco, или DMEM с 10% эмбриональной сывороткой теленка (FCS) и выращивают при 37 °C в атмосфере, содержащей 5%_CO2.
   2. Засейте клетки с плотностью 50 000 на лунку в предметное стекло с 8 лунками (Ibidi) и инкубируйте в течение ночи (O/N).
2. Культура бактерий
   1. Используйте штамм дикого типа (WT) Salmonella enterica serovar Typhimurium NCTC 12023. Для сравнения используют мутантные штаммы ΔssaV, дефектные в SPI2-T3SS, и ΔsifA, в котором отсутствует ключевой эффектор SifA для SIF. Используйте штаммы, содержащие плазмиду pFPV25.1, для конститутивной экспрессии усиленного GFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальные штаммы обычно культивируют в бульоне Лурии-Бертани (LB) с добавлением 50 мкг/мл карбенициллина (WT) и LB с добавлением 50 мкг/мл карбенициллина и/или 50 мкг/мл канамицина (ΔssaV, ΔsifA) необходимых для поддержания плазмид.
   2. Инокулируйте одну колонию бактерий в 3 мл LB соответствующими антибиотиками и выращивайте O/N при 37 ºC в условиях встряхивания для аэрации, затем разведите 1:31 в свежем LB и продолжайте рост в течение 3,5 часов. В этот момент культуры достигают поздней логарифмической фазы, и бактерии очень инвазивны. «Роликовый барабан» удобен для инкубации культур из пробирки с аэрацией.
3. Инфицирование клеток HeLa наночастицами сальмонеллы и золота-BSA-родамина или NPs Pulse Chase-label (см. схему на рисунке 1)
   1. Измерьте OD₆₀₀ субкультурных бактерий и разбавьте до OD₆₀₀ = 0,2 в 1 мл фосфатно-солевого буфера или PBS (~3 × 10⁸ КОЕ/мл), добавляют соответствующее количество бактерий к клеткам HeLa в 8-луночных камерных предметных стеклах для достижения кратности инфекции (MOI) 100.
   2. Инкубировать в течение 30 минут в клеточном инкубаторе, 3 раза промыть PBS для удаления неинтернализованных бактерий (этот момент времени был установлен как 0 часов после заражения или 0 часов после заражения). Добавьте 300 μл свежей питательной среды, содержащей 100 μг/мл гентамицина, и выдержите в течение 1 часа. Затем замените среду свежей средой, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, на оставшееся время инкубации.
   3. После инкубации с питательной средой, содержащей 100 мкг/мл гентамицина, в течение 1 ч среду заменяют средой для визуализации (Eagle's MEM без FCS, L-глютамина, фенолового красного и бикарбоната натрия, с 30 мМ HEPES, pH 7,4), содержащей 10 мкг/мл гентамицина. НЧ голд-БСА-родамин добавляют в клетки HeLa для получения конечной концентрации OD₅₂₀ = 0,1. (Сывороточный альбумин крупного рогатого скота, или БСА)
      ПРИМЕЧАНИЕ: НЧ голд-БСА-родамин также могут добавляться в клетки до инфицирования или в различные моменты времени.
   4. После 1 часа инкубации удалите среду, промойте 3 раза PBS и добавьте 300 μл свежей среды для визуализации, содержащей 10% FCS и 10 μг/мл гентамицина, до конца инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность инкубации может варьироваться в зависимости от концентрации NP и используемых клеточных линий. Для макрофагов RAW264.7 мы заметили, что 30-минутная инкубация с НЧ в концентрации OD₅₂₀ = 0,05 обеспечивает достаточную интернализацию.

Результаты

Рисунок 1. Схема подготовки клеток HeLa к визуализации живых клеток. Клетки HeLa высевали в предметных стеклах, инфицировали или инфицировали различными штаммами сальмонеллы в течение 30 минут, 3 раза промывали PBS, затем инкубировали ...

Материалы