Культивирование микобактерий туберкулеза в условиях повышенного содержания железа

Аннотация

Источник: Gupta, S., et al. Выделение и характеристика внеклеточных везикул, продуцируемых микобактериями с ограниченным содержанием железа. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео показана процедура культивирования Mycobacterium tuberculosis в условиях с ограниченным содержанием железа для индуцирования железного стресса и стимуляции секреции сидерофоров, поддерживающих выживание бактерий.

Протокол

1. Выращивание микобактерий в условиях ограниченного содержания железа

1. Разморозьте 50 мкл замороженного 15% глицеринового запаса Mtb (Mycobacterium tuberculosis) и разомните агаровую пластину с добавлением обогащения 10% ADN (альбумин – декстроза – NaCl) (5 г/л альбумина, 2 г/л декстрозы и 0,85 г/л натрия хлорида, 0,2% глицерина и 0,05% Tween-80). Инкубируйте планшет при температуре 37 °C до тех пор, пока не станут видны колонии.
2. Инокулируют одну колонию Mtb в 2 мл среды микобактериального бульона (Таблица материалов) с обогащением ADN. Инкубировать с перемешиванием при 37 °C.
3. Пусть культура Mtb дорастет до поздней логарифмической фазы (OD₅₄₀ составляет ~0,8). Чтобы проверить это, измерьте наружный диаметр₅₄₀ с помощью спектрофотометра.
4. Распределите 200 мкл поздней логарифмической культуры на агаровые планшеты микобактерий (Таблица материалов) с добавлением 0,2% глицерина, 0,05% Tween-80 и ADN. Привите не менее 5 пластин. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C до тех пор, пока рост бактерий не станет виден в виде сливающегося слоя. Для Mtb это занимает ~1 неделю.
5. Намочите стерильный ватный тампон в LIMM (среда с низким содержанием железа). Используйте этот тампон для сбора бактерий с агаровых пластин и инокулируйте 100 мл LIMM для приготовления концентрированной бактериальной суспензии с наружным диаметром₅₄₀ ~1,0.
6. Разведите эту суспензию в 10 раз до 1 л с LIMM и разделите на две стерильные пластиковые бутылки по 2 л, каждая из которых содержит 500 мл культуры.
7. Выньте 2 мл культуры и переложите ее в пробирку для культуры объемом 5 мл. Добавьте 10 мкл 10% об/об. тилоксапола.
8. Инкубируйте культуры при температуре 37 °C в течение 14 дней.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Миддлбрук 7H10 Агар	BD Difco	262710	Микобактериальные агаровые пластины
Миддлбрук 7H9 Бульон	BD Difco	271310	Микобактериальная бульонная среда
Полипропиленовая тонкостенная центрифужная трубка 13х15 мм	Бекман Коултер	344059	Полипропиленовая тонкостенная центрифужная трубка 13х15 мм
Колбы вакуумной фильтрации	СеллПро	В50022	Фильтрующий блок