Выделение сидерофорсодержащих внеклеточных везикул из Mycobacterium tuberculosis

Аннотация

Источник: Гупта, С., Марсела Родригес, Г. Выделение и характеристика внеклеточных везикул, продуцируемых микобактериями с ограничением железа. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео показано поэтапное выделение внеклеточных везикул (ВВ) из Mycobacterium tuberculosis , культивируемых в железоограничивающих условиях, имитирующих среду хозяина. В нем описывается использование ультрафильтрации, дифференциального центрифугирования и разделения по градиенту плотности для обогащения и идентификации фракций, содержащих EV.

Протокол

1. Сбор внеклеточных везикул микобактерий (МЭВ)

1. Измерьте наружный диаметр₅₄₀ 2 мл культуры во время сбора. Сделайте последовательные разведения культуры в соотношении 1:10 и нанесите 100 мкл каждого разведения на агаровые планшеты с ADN и 0,05% Tween-80.
2. Переложите культуру в пять конических пробирок для центрифуги объемом 225 мл и центрифугируйте при давлении 2 850 x g в течение 7 минут при 20 °C.
3. Соберите надосадочную жидкость культуры с помощью пипетки объемом 50 мл и простерилизуйте ее через фильтрующую установку 0,22 мкм.

2. Изоляция МЭВ

1. Перенесите фильтрат культуры в систему ультрафильтрации с перемешиванием клеток, помещенную при температуре 4 °C, и отфильтруйте концентрат при давлении <50 фунтов на квадратный дюйм через отсечную мембрану 100 кДа до ~50 мл.
2. Центрифугируйте концентрированный культуральный фильтрат при 15 000 x g в течение 15 мин при 4 °C и соберите надосадочную жидкость.
3. Центрифугируйте фильтрат культуры в поликарбонатных ультрацентрифугирующих пробирках при давлении 100 000 x g в течение 2 ч при 4 °C.
4. Ресуспендируйте мембранные гранулы в общей сложности 1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) с помощью щадящего пипетирования.
5. Смешать 0,5 мл гранулированной суспензии, полученной на стадии 2.4, с 1,5 мл 60% раствора йодиксанола, получив конечную концентрацию йодиксанола 45% мас./об. Выложите эту смесь на дно полипропиленовой тонкостенной ультрацентрифужной пробирки размером 13 x 51 мм.
6. Сверху наложите суспензию MEV-йодиксанол 45% с 1 мл 40%, 35%, 30%, 25% и 20% (об/об. в PBS) и 1 мл PBS.
7. Центрифуга при 100 000 x g в течение 18 ч при 4 °C.
8. Соберите фракции градиента плотности объемом 1 мл, начиная сверху, с помощью шприца Hamilton объемом 1 мл.
9. Разбавьте каждую собранную фракцию до 20 мл с помощью PBS и центрифугируйте при 100 000 x g в течение 2 ч при 4 °C.
10. Удалите надосадочную жидкость и суспендируйте гранулу в 0,5 мл PBS. Храните эту гранулу при температуре 4 °C.

Материалы