$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Штаммы бактерий и условия культивирования
ЗАМЕТКА: В этом исследовании использовались следующие штаммы бактерий: Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve и Bifidobacterium dentium.
1. Для E. coli используйте стерильную петлю для инокуляции отдельных колоний в 250–1 000 мл бульона Лурия-Бертани (LB) и инкубируйте аэробно в встряхивающем инкубаторе при 300 об/мин и 37 °C в течение 48 часов перед обработкой культуры. Для рекомбинантного штамма E. coli MP1, содержащего p114-mCherryClyluc, добавляют хлорамфеникол в агар LB и бульон в конечной концентрации 17 мкг/мл.
2. Для A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve и B. dentium нанесите полосу на агаровые планшеты Brain Heart Infusion (BHI) и анаэробно инкубируйте внутри виниловой анаэробной камеры. Инокулируйте отдельные колонии в 100 мл предварительно восстановленного бульона BHI и инкубируйте в течение 48 ч анаэробно.
2. Изоляция электромобиля
1. Осветление бактериальной питательной среды методом центрифугирования и фильтрации
1. Перенесите бактериальные клеточные культуры, инокулированные на этапе 1, в чистые полипропиленовые центрифуги объемом 250 мл или 500 мл путем заливки. Центрифугируйте флаконы в роторе большой емкости с фиксированным углом наклона при температуре 4 °C и 5 000 × г в течение 15 минут. Осторожно перелейте надосадочную жидкость в чистые бутылки центрифуги и снова центрифугируйте при 10 000 × г в течение 15 минут.
ЗАМЕТКА: Используйте бутылки повторно после очистки и обеззараживания в соответствии с биобезопасностью.
1. Если после второго центрифугирования присутствуют большие гранулы бактериальных клеток, повторите центрифугирование в чистой бутылке для дальнейшего удаления клеток.
2. Перенесите надосадочную жидкость в полиэфирсульфоновый вакуумный фильтрующий аппарат соответствующего размера размером 0,22 мкм путем заливки. Фильтруйте, подключив фильтрующее устройство к вакуумной настенной сети. Если скорость фильтрации значительно падает, просто переместите неотфильтрованный материал в новое устройство. Храните отфильтрованную среду при температуре 4 °C в течение ночи и при желании продолжайте протокол на следующий день.
ЗАМЕТКА: Приведенные выше центрифугирования обычно позволяют обрабатывать в ~2 раза больше указанного объема клеточной культуры через каждое устройство. Например, одно фильтрующее устройство объемом 500 мл может отфильтровать ~1000 мл предварительно центрифугированной культуры. Эти устройства обычно не используются повторно. Использование шприцевых фильтров на этом этапе не рекомендуется без оптимизации, так как с тестируемыми моделями были отмечены значительные потери. Это потенциальный пункт остановки.
3. Проверьте полное удаление жизнеспособных клеток на этом этапе, распределив аликвоту отфильтрованной надосадочной жидкости на подходящие агаровые планшеты, и убедитесь в отсутствии каких-либо колоний после инкубации в оптимальных условиях для бактериального штамма. При обнаружении бактерий дополнительно оптимизируйте описанную выше процедуру, выполнив дополнительные центрифугирования и/или фильтрации.
2. Концентрация отфильтрованной среды
1. Если вы работаете с объемами значительно >100 мл, перейдите к пункту 2.2.2. При работе с объемами ~100 мл загрузите 90 мл отфильтрованной питательной среды в резервуар соответствующей емкости 100 кДа центробежного ультрафильтрационного устройства с отсечкой молекулярной массы (MWCO) с помощью серологических пипеток. Всегда балансируйте с помощью подходящего ультрафильтрационного устройства и центрифугируйте в качающемся роторе ведра при температуре 4 °C и 2 000 × г в течение 15-30 минут, пока объем среды в верхнем резервуаре не концентрируется до <0,5 мл.
1. Долейте в резервуар оставшуюся отфильтрованную питательную среду. Если вы «доливаетесь», удалите проточный канал в нижней части устройства и восстановите баланс всех устройств.
ЗАМЕТКА: Было замечено, что максимальный объем отфильтрованной питательной среды, который может быть сконцентрирован с помощью этих устройств, в <2 раза превышает рекомендуемый объем.
2. Если вязкость концентрированной среды в резервуаре заметно увеличена (темный, вязкий материал), разбавьте фосфатно-солевым буфером (PBS) и повторно сконцентрируйте центрифугированием, чтобы разбавить любые не-EV белки меньше, чем MWCO 100 кДа.
ЗАМЕТКА: Это потенциальный пункт остановки.
3. Переложите концентрированную среду в пробирку с низким уровнем связывания белков, храните при температуре 4 °C в течение ночи и при желании продолжите протокол на следующий день.
2. При работе с объемами, значительными >100 мл, выберите устройство тангенциальной фильтрации потока (TFF) соответствующего размера (100 кДа MWCO) для размещения обрабатываемого объема.
ЗАМЕТКА: Фильтрующие устройства для обработки от 100 мл до > 1 000 мл коммерчески доступны. Местная доступность, стоимость и совместимость с насосом и трубками/соединениями будут определять, какие конкретные модели будут наиболее полезными. До 2 л питательной среды обрабатывали устройством, указанным в Таблице материалов, перед очисткой фильтра (протокол очистки см. в шаге 2.3 ниже).
1. Соберите контур фильтрации с трубками #16 с низким связыванием и низким уровнем выщелачивания, шлангом-шипом 1/8 дюйма для адаптеров Люэра, устройством TFF и перистальтическим насосом.
ЗАМЕТКА: Выполняйте TFF в шкафу биобезопасности, чтобы свести к минимуму риск загрязнения препарата EV бактериями окружающей среды.
2. При комнатной температуре начните циркуляцию отфильтрованной, кондиционированной среды со скоростью примерно 200 мл/мин (минимум 100 мл/мин). Определите подходящую частоту вращения, соответствующую желаемому расходу, закачав 200 мл PBS в градуированный сосуд. При циркуляции отфильтрованной, кондиционированной среды соберите молекулы <100 кДа, пересекающие ультрафильтрационную мембрану, в качестве отходов в отдельном сосуде.
ЗАМЕТКА: В приведенном ниже примере предполагается, что начальный объем культуры составляет 2 л.
3. Продолжайте циркуляцию кондиционированной среды до тех пор, пока ее объем не уменьшится до ~100-200 мл. При необходимости пересаживайтесь на суда меньшего размера. Разбавьте PBS в 2 раза, и продолжайте циркулировать с помощью помпы, концентрируясь до 75-100 мл. Разбавьте PBS в 2 раза и продолжайте циркулировать до конечного объема 25 мл. Разведите в 2 раза с PBS и продолжайте циркулировать до <10 мл.
4. Извлеките питательную трубку из резервуара для проб и продолжайте откачку, чтобы продуть фильтр и собрать максимальное количество пробы.
ЗАМЕТКА: Это потенциальный пункт остановки.
5. Переложите концентрированный образец в коническую пробирку и при желании храните в течение ночи при температуре 4 °C. В качестве альтернативы можно продолжить работу по протоколу.
6. Переместите концентрированный образец в центробежное ультрафильтрующее устройство MWCO емкостью 15 мл и емкостью 100 кДа. Центрифугируйте в роторе с качающимся ковшом при температуре 4 °C и 2 000 × г с интервалом 15-30 минут до тех пор, пока объем среды в верхнем резервуаре не концентрируется до <2 мл.
ЗАМЕТКА: Это потенциальный пункт остановки.
7. Переложите концентрированную среду в пробирку с низким уровнем связывания белка и храните при температуре 4 °C в течение ночи, при желании продолжая протокол на следующий день.