$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Эксклюзионная хроматография (SEC)
ЗАМЕТКА: SEC используется для повышения чистоты внеклеточных везикул (ВВ) и удаления невезикулярного белка.
- Используйте небольшую колонну SEC (объем слоя 10 мл) для изоляции EV от <100 мл исходного материала и большую колонну (объем слоя 47 мл) для изоляции EV от >100 мл исходного материала.
ЗАМЕТКА: В приведенном ниже примере будут перечислены тома для большего столбца, а в скобках — объемы для меньшего столбца. - Доведите колонку SEC и фосфатно-солевой буфер (PBS) до комнатной температуры в течение нескольких часов. Стабилизируйте колонну SEC в вертикальном положении с помощью стандартной лабораторной стойки и держателя. В качестве альтернативы можно использовать коммерческие стойки для колонок для хроматографии.
- Перед подключением к колонне SEC увлажните резервуар для пробы, позволив 5 мл PBS протечь через фритту и попасть в контейнер для отходов. Открутите входную крышку колонны SEC, добавьте 2 мл PBS в резервуар для образца и осторожно подсоедините резервуар к колонне, так как PBS капает через фритту (не применимо для небольших колонок SEC). ЗАМЕТКА: Этот предыдущий шаг предотвращает попадание пузырьков воздуха в верхнюю часть столбца SEC. Если воздух застрял, снимите резервуар, постучите по колонке, чтобы выпустить пузырь воздуха, и повторите процедуру подключения. Для меньшей колонны просто снимите крышку верхней части колонны SEC и прикрепите бункер для образцов.
- Добавьте 47 мл (10 мл) PBS в резервуар для проб и откройте дно колонки SEC. Позвольте всему загруженному буферу выборки пройти через столбец для уравновешивания. Откажитесь от проточного потока.
- Загрузите не более 2 мл (0,5 мл) образца в резервуар для пробы, отбросьте проточный поток и дайте образцу полностью войти в колонку.
- Немедленно добавьте PBS в резервуар для проб или бункер объемом 14,25 мл за вычетом объема пробы (3 мл минус объем пробы, для малой колонки). Дайте раствору протечь через колонну и отбросьте это количество, равное объему пустот в колонке.
ЗАМЕТКА: Для типичной пробы объемом 2 мл количество PBS, которое должно быть добавлено в резервуар для проб или бункер, составит 12,25 мл. - Поместите микропробирку с низким связыванием объемом 2 мл непосредственно под колонкой SEC. Немедленно добавьте 2 мл (0,5 мл) PBS в резервуар для образца и дайте ему войти в колонку. Пометьте первые 2 мл (0,5 мл) проточного потока как фракцию 1. Продолжайте добавлять по 2 мл (0,5 мл) за один раз в резервуар для пробы, чтобы собрать каждую последующую фракцию.
ЗАМЕТКА: Большинство бактериальных EV элюируются в первых 5 фракциях. В ходе оптимизации были собраны первые 12 фракций. - Хранить фракции при температуре 4 °С при кратковременном хранении (сутках) или при температуре -80 °С при длительном хранении.