Бактериальная трансинфекция Т-клеток in vitro путем формирования иммунологических синапсов

Аннотация

Источник: Cruz-Adalia, A., et al. Т-клетки захватывают бактерии путем трансинфекции из дендритных клеток. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео демонстрируется бактериальная трансинфекция через антиген-специфические взаимодействия Т-клеток с дендритными клетками. Инфицированные бактериями дендритные клетки, представляющие пептид овальбумина, инкубируются с Т-клетками либо непосредственно, либо разделены мембраной. Прямой контакт позволяет формировать иммунологические синапсы, способствуя передаче бактерий, в то время как мембрана предотвращает взаимодействие. Затем проводится лечение гентамицином для уничтожения внеклеточных бактерий.

Протокол

Примечание: Мышей разводили в специальных помещениях, свободных от патогенов (SPF), и их усыпляли обученным и квалифицированным персоналом с использованием метода ингаляции углекислым газом (CO₂).
1. Дифференцировка дендритных клеток (ДК) из костного мозга мышей и инфекцияПримечание: На рисунке 1 представлен этот первый шаг. С этого момента все процедуры следует проводить в вытяжке, используя только стерильные среды, инструменты, наконечники для пипеток и посуду для культивирования.

1. Дифференцировка ДК, полученных из костного мозга мыши,
   1. Рассеките голени и бедренные кости у одной мыши C57/BL6 и переложите их в пластиковую чашку с 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
   2. Срежьте каждый эпифиз, стерильными ножницами и обнажите костный мозг, который имеет характерный ярко-красный цвет.
   3. Введите внутрь кости 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) (PBS/BSA/EDTA buffer) с помощью стерильного шприца на стерильной чашке Петри.
   4. Соберите клеточную суспензию и центрифугу в пробирку при температуре 600 x g в охлаждаемой центрифуге (4 °C).
   5. Ресуспендируйте клетки в 1 мл лизирующего буфера хлорида аммония и калия (ACK) (0,15 М хлорида аммония (NH₄Cl), 10 мМ бикарбоната калия (KHCO₃) и 0,1 мМ ЭДТА) и инкубируйте в течение 30 секунд при комнатной температуре (RT) с целью элиминации эритроцитов.
   6. Добавьте 10 мл среды RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и профильтруйте через клеточный фильтр (70 мкм) для удаления костных фрагментов и клеточных комков перед центрифугированием с той же скоростью (600 xg), поскольку комки были удалены фильтрацией.
   7. Подсчитайте клетки и доведите до 5 x 10⁵ клеток/мл с помощью RPMI 10% FBS (содержащего 50 мкМ B-меркаптоэтанола, 1 мМ пирувата натрия) и добавьте 20 нг/мл рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора мыши (rm-GM-CSF) в качестве конечной концентрации.
   8. Добавьте эту суспензию в стерильную чашку Петри микробиологического качества высотой 15 см и заквашивайте в инкубаторе с_СО2 (37 °С, 5%_СО2).
   9. Каждые три дня снижайте как неадгезивные, так и отделенные клетки с 5 мМ ЭДТА в PBS и ресуспендируйте при плотности 5 x 10⁵ клеток/мл клеток, со свежей средой, содержащей 20 нг/мл rm-GM-CSF.
2. Созревание ДК и загрузка антигенов
   1. На 9-й день ресуспендируйте клетки при плотности 5 x 10⁵ клеток/мл в среде, содержащей 20 нг/мл rm-GM-CSF. Затем добавьте 20 нг/мл липополисахарида (ЛПС) для обеспечения высокой экспрессии главного комплекса гистосовместимости или MHC-II на клетках и инкубируйте в стерильной чашке Петри размером 15 см без обработки тканевых культур в течение 24 часов.
   2. После одного дня ЛПС-стимуляции окрашивайте некоторые клетки DC антителами против мышиного CD11c, MHC-II и рецептора гранулоцитов-1 или Gr-1, чтобы проверить дифференцировку DC с помощью проточной цитометрии. Пример анализа ДК с помощью проточной цитометрии представлен на рисунках 3А и 3В.
      1. Инкубируйте ДК (5 x 10,⁵ клеток/образец) с моноклональным антителом против мышей CD16/CD32 в концентрации 2,5 мкг/мл в буфере 50 мкл PBS/BSA/EDTA. После этого добавьте 50 мкл антител против MHC-II (I-A/I-E), CD11c и Gr-1, конъюгированных с различными флуорохромами в соотношении 1:100, 1:200 и 1:500 в буфере PBS/BSA/EDTA, соответственно.
      2. Наконец, промойте ДК буфером PBS/BSA/EDTA и проанализируйте с помощью проточной цитометрии в соответствии с протоколом производителя.
         Примечание: Если клетки хорошо дифференцированы, они готовы к загрузке антигенами.
   3. Промывайте ДК RPMI 10% FBS (без антибиотиков) и инкубируйте их с пептидом овоальбумина (OVAp) в дозе 10 мкг/мл OTII (OVAp) (OVA 323-339; И С К А В А Х А Х А Е И Н Е А Г Р) на пластиковой пробирке в 1 мл среды RPMI 10% FBS на 5 x 10⁶ DCs в течение минимум 1 часа при 37 ºC. В качестве отрицательного контроля оставьте ДК без инкубации с OVAp.
3. Заражение ДК
   1. Заражайте ДК при кратности инфекции (MOI) 10 бактерий (10 бактерий на ДК) в течение 1 часа в инкубаторе с_СО2 (37 °С, 5%_СО2).
   2. Промойте клетки постоянного тока 3 раза в PBS и 1 раз в RMPI 10% FBS и центрифугируйте при 450 x g, чтобы промыть большую часть внеклеточных бактерий. Наконец, ресуспендируйте клетки в среде RMPI 10% FBS (без антибиотиков) в концентрации 20 x 10⁶ клеток/мл.

2. Выделение CD4⁺ Т-лимфоцитов из трансгенных мышей OTII.Примечание: На рисунке 1 обобщен этот второй этап. Для выделения CD4⁺ Т-клеток следует использовать лимфатические узлы вместо селезенки, поскольку доля CD4⁺ лимфоцитов в лимфатических узлах (~50%) больше, чем в селезенке (~25%) и поэтому очищение будет более эффективным.

1. Сделать одноклеточную суспензию лимфатических узлов
   1. Удалите паховые, подмышечные, плечевые, шейные и брыжеечные лимфатические узлы у трансгенных мышей OTII и перенесите их в пластиковую чашку с 10 мл среды RPMI 10% FBS.
   2. Измельчите лимфатические узлы под стерильным колпаком с помощью двух матовых предметных стекол микроскопа. Поместите лимфатические узлы на матовую сторону одного предметного стекла микроскопа и растирайте матовой стороной второго предметного стекла до тех пор, пока органы не будут измельчены.
   3. Промойте одноклеточную суспензию в буфере PBS/BSA/EDTA.
   4. Отфильтруйте клетки через сетчатое фильтр (70 мкм) для удаления соединительной ткани и промойте буфером PBS/BSA/EDTA.
   5. Ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера для лизиса ACK и инкубируйте в течение 1 минуты в режиме лучевой терапии с целью элиминации эритроцитов.
2. Выделение CD4⁺ Т-клеток
   1. Промойте еще раз, как в шаге 2.1.3, и подсчитайте клетки для их ресуспендирования в соотношении 100 x 10⁶ клеток/мл в буфере PBS/BSA/EDTA. Добавьте биотинилированные антитела против CD8, IgM, B220, CD19, MHC класса II (I-Ab), CD11b, CD11c и DX5 в течение 1:250 в течение 30 минут на льду для последующего отрицательного отбора CD4⁺ Т-клеток.
   2. Промойте клетки в буфере PBS/BSA/EDTA и инкубируйте клетки (100 x 10⁶ клеток/мл) с микрогранулами стрептавидина в концентрации, рекомендованной в протоколе производителя, в течение 15 минут на льду.
   3. Промойте клетки в буфере PBS/BSA/EDTA и отфильтруйте их через сетчатое фильтр (30 мкм) перед выделением CD4⁺ Т-клеток.
   4. Выделите CD4⁺ Т-клетки путем отрицательного отбора с помощью магнитной машины для разделения клеток в соответствии с протоколом производителя.
   5. Подсчитайте количество клеток и отрегулируйте до 4 x 10⁶ клеток/мл с помощью среды RPMI 10% FBS (без антибиотиков).
   6. Фиксируют и держат на льду изолированные CD4⁺ Т-клетки (3 х 10,⁵ клеток) для проверки чистоты с помощью проточного цитометра. Пример очистки CD4⁺ Т-клеток показан на рисунке 3C.

3. Измерение трансинфекции Т-клеток с помощью анализа на защиту гентамициномПримечание: На рисунке 2 обобщен этот третий этап протокола.

1. Трансинфекция Т-клеток

1. Инкубируйте изолированные CD4⁺ Т-клетки с инфицированными DC-клетками (1:1) (DC инфицировали в течение 1 часа и промывали для уничтожения свободных бактерий) в течение 30 минут, чтобы обеспечить образование иммунных синапсов в инкубаторе CO₂ (37 °C, 5% CO₂).

2. Добавьте 0,5 мл выделенных CD4⁺ Т-клеток (2 x 10⁶ клеток) и 0,1 мл инфицированных DCs (2 x 10⁶ клеток) на 24-луночный культуральный планшет. В качестве отрицательного контроля инфицируйте непосредственно 0,5 мл CD4⁺ Т-клеток при MOI 10 бактерий в течение 30 минут.

3. Включите дополнительные меры контроля, отделяющие инфицированные ДК от Т-клеток с помощью поликарбонатного трансвелл-барьера (с размером пор 3 мкм), препятствующие физическому контакту ДК-Т. Добавьте 0,1 мл ДК внутрь транслунла и 0,5 мл CD4⁺ Т-клеток в нижний отсек лунки (24-луночный планшет).

4. Наконец, добавьте среду RMPI до тех пор, пока в каждой лунке не останется 0,6 мл, чтобы получить равные объемы во всех образцах.

5. Через 30 минут после формирования иммунных синапсов добавьте 100 мкг/мл гентамицина и инкубируйте в течение 1 часа перед сбором клеток в инкубаторе с_СО2 (37°С, 5%_СО2).

Результаты

Рисунок 1. Технологическая схема генерации ДК и выделения CD4⁺ Т-клеток. В левой части рисунка подробно описан процесс дифференцировки дендритных клеток (ДК) от клеток костного мозга. После рассечения бедренных и большеберцовых ко...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
РПМИ	Научный центр Фишера	SH3025501
r-GMCSF	Пепротех	315-03
ЛПС	СИГМА	Л2630-10мг
На пирувате	Термо Сайентиал	SH3023901
2-МЕ	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323–339)	GenScript	---
Сетчатый фильтр 70 мкМ	БД	352350
Шприц 30 мкМ Filcons стерильный	БД	340598
АвтоМаки Классика	Милтеньи Биотек	130-088-887
Гентамицин	Нормон	624601.6
Трансвелл	Костар	3415
ФУНТ	Пронадиса	1231
Агар	Пронадиса	1800
Параформальдегид 16%	Науки электронной микроскопии	15710
Тритон Х-100
CD8 био	BD Biosciences	553029
IgM Biot	ИммуноСтеп	Клон РММ-1
В220 Био	BD Biosciences	553086
CD19 био	BD Biosciences	553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)	BD Biosciences	553622
CD11b био	Иммуностеп	11BB-01мг
Био CD11c	Иммуностеп	11КБ3-01мг
DX5 био	BD Biosciences	553856
Гр-1 био	BD Biosciences	553125
CD16/CD32	ИммуноСтеп	М16ПУ-05МГ
антисальмонелла	АБД Серотек	8209-4006
КД11ПЭ	BD Biosciences	553802
CD4-APC	Тонбо Бионаука	20-0041-У100
БТР Гр-1	BD Biosciences	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biosciences	553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) антитело, с высокой степенью перекрестной адсорбции	Инвитроген	А-21245
CMAC (7-амино-4-хлорметилкумарин)	Технологии жизни	С2110
БСА	СИГМА	А7030-100Г
Стрептавидин Микрогранулы	Милтеньи Биотек	130-048-101
BD FACSКанто II	BD Biosciences	---