Фототаксисный анализ нитчатых цианобактерий с использованием сфокусированного светового освещения

Аннотация

Источник: Weber, N. et al., Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется целенаправленный анализ на основе светодиодов для изучения фототаксиса у нитевидных цианобактерий. Бактерии мигрируют к источнику света, образуя плотное скопление в освещенном центре, которое визуализируется и количественно оценивается с помощью анализа интенсивности пикселей захваченного изображения.

Протокол

1. Анализ на фототаксис
   1. Для экспериментов с фототаксисом подготовьте держатели светодиодов (LED) (здесь с помощью 3D-принтера), в которые установлены выбранные светодиоды диаметром 5 мм для облучения области 20^мм2 снизу вверх (рис. 1). При необходимости используйте несколько держателей светодиодов параллельно, подключая каждый светодиод электрически через резистор и потенциометр к регулируемому источнику питания. Измеряйте и регулируйте интенсивность светодиодов в зависимости от эксперимента. Убедитесь, что вся обстановка находится в темной комнате или закрытом темном контейнере.
   2. Поместите 8 мл среды, содержащей Phormidium lacuna , в чашку Петри диаметром 6 см. Отрегулируйте интенсивность света светодиода. Закройте чашку Петри крышкой и поставьте ее на держатель для светодиодов так, чтобы светодиод находился в центре чашки Петри.
   3. По истечении желаемого периода времени (обычно 2 дня) сделайте снимок чашки Петри с помощью камеры смартфона, направленной непосредственно на место световой обработки. Используйте белую светодиодную панель для облучения образца. Используйте ручные настройки камеры; избегать отражений света; Всегда регулируйте так, чтобы расстояние между объективом камеры и образцом было одинаковым. Убедитесь, что настройки экспозиции позволяют получить изображение, пригодное для последующего анализа с помощью ImageJ.
   4. Количественно измерьте диаметр центрального круга нитей накаливания с помощью программного обеспечения ImageJ.
      1. Откройте ImageJ, нажмите на Файл | Откройте, выберите нужный файл и нажмите Enter.
      2. Выберите кнопку Прямая (с прямой линией). Нажмите левую кнопку мыши, чтобы провести линию от одного конца чашки Петри к противоположному концу. Следите за тем, чтобы леска проходила через центр круга из нитей.
      3. Нажмите Ctrl-K на клавиатуре или нажмите «Анализировать» | Plot Profile в меню ImageJ. Ищите x-y окно с графиком зависимости интенсивности пикселей от расстояния — 1D-профиль чашки Петри. Убедитесь, что самая низкая интенсивность пикселей немного выше 0, а максимальное значение — ниже 255.
      4. Оцените среднее значение интенсивности пикселей за пределами круга и другое среднее значение интенсивности пикселей в круге. В положении y между этими значениями оцените значения x обеих сторон круга, указав мышь на эти позиции. Запишите оба значения и рассчитайте разницу.
      5. Получите наибольшее значение x, наведя мышь на ось y справа. Обратите внимание, что это значение e представляет собой диаметр чашки Петри. Если этот диаметр равен 5 см, то рассчитайте диаметр центральной окружности нити как d/e × 5 см.

Результаты

Рисунок 1: Эксперимент с фототаксисом. Слева: держатель светодиодов с 4 красными светодиодами, подключенный к регулируемому источнику питания. В верхней части каждого светодиода находится чашка Петри диаметром 6 см с 8 мл культуры Phormidium lacuna. Справ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашки Петри из полистирола, 60 мм x 15 мм	Мерк	П5481-500ЭА
Фотометр Nanodrop ND-1000	Peqlab Biotechnologie
Фотометр Uvikon XS	Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Пипетман 10-100 μл	Гилсон	Артикул: FA10004M
программное обеспечение, URL
ИзображениеJ		Программное обеспечение для обработки иммажа (интенсивность пикселей, диаметр круга)
Питательные среды
f/2 -жидкая среда	искусственная морская вода, 0,1 % (v/v) раствор микроэлемента, 0,05 % (v/v) раствор витаминов, 0,88 мМ нитрат натрия, 36 мкМ мононатрия фосфат