Оценка прикрепления пневмококка к первичным эндотелиальным клеткам человека при постоянном потоке среды

Аннотация

Источник: Jagau, H. et al. Пневмококковая инфекция первичных эндотелиальных клеток человека в постоянном потоке. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео в режиме реального времени демонстрируется визуализация присоединения пневмококка к нитям фактора Виллебранда (VWF) на эндотелиальных клетках в условиях постоянного потока среды. В нем изложены шаги по стимулированию высвобождения VWF, маркировке строк и количественной оценке бактериального связывания.

Протокол

1. Индукция фактора Виллебранда (VWF) - высвобождение и визуализация мультимеризованных струн VWF

1. Поддерживайте настройку текучести, так как напряжение сдвига 10 дин/^см2 требуется для запуска мультимеризации VWF на длинные колонны до 200 MDa. Индуцировать высвобождение VWF из эндотелиального WPB путем введения 136 мкл 100 мМ стокового раствора гистамина в питательную среду для эндотелиальных клеток с циркуляцией смеси добавок (ECGMS) в перфузионной трубке с помощью инъекционного порта. Конечная концентрация гистамина в проточной среде составит 1 мМ. Если отверстие для инъекции недоступно, гистамин может быть добавлен в качестве альтернативы путем пипетирования в среду резервуаров насоса.
2. Для иммунофлуоресцентного детектирования мультимеризованных гирлянд VWF необходимо остановить поток при достижении сбалансированного уровня среды в резервуарах и ввести 20 мкг VWF-специфичного флуоресцеин-изотиоцианата (FITC)-конъюгированного антитела в объеме 200 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) (pH 7,4) в циркулирующие 13,6 мл ECGMS-среды с использованием инъекционного порта. Если порт для инъекции недоступен, антитело может быть добавлено в качестве альтернативы путем дозирования в среду резервуаров насоса. В результате конечная концентрация антител составляет 1,3 мкг/мл.
3. Для микроскопического сканирования нескольких полей зрения за короткое время используйте флуоресцентный блок микроскопа с ксеноновым флуоресцентным прибором мощностью 30% и эпифлуоресцентной камерой. Мониторинг формы и морфологии слоя эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) в режиме яркого поля для выбора репрезентативных клеток, подходящих для визуализации VWF-струн.
4. Для визуализации зеленых флуоресцентных струн VWF выберите масляный объектив 63x/1.40 и фильтр обнаружения 470 нм в меню флуоресцентных блоков программного обеспечения микроскопа (LasX). Создание моментальных снимков Z-стеков, состоящих не менее чем из 50 репрезентативных полевых представлений, каждый из которых содержит примерно 10 морфологически неповрежденных HUVEC. Для количественного определения зеленых флуоресцентных струн VWF в разные моменты времени отсканируйте несколько полей зрения.

2. Микроскопическая оценка прикрепления бактерий к VWF-струнам в потоке в режиме реального времени

1. Количественно оцените присоединение пневмококка к VWF-нитям, генерируемым на поверхностях клеток HUVEC, с помощью иммунофлуоресцентного детектирования.
   1. Удерживайте поток и введите 1,35 x 10⁸ КОЕ/мл красных флуоресцентных белков (RFP) пневмококков, экспрессирующих красные флуоресцентные белки (RFP), в максимальном объеме 1 мл в среду ECGMS с помощью порта для инъекций. В качестве альтернативы можно дозировать бактерии в среду в резервуаре насоса. Возобновите напряжение сдвига с коэффициентом 10 дин/^см2 , чтобы бактерии циркулировали в насосной системе.
   2. Выберите 63-кратный масляный иммерсионный объектив для увеличения микроскопа и настройте флуоресцентный фильтр в программном обеспечении микроскопа на RFP-канал (фильтр обнаружения 540 нм) для обнаружения RFP-экспрессирующих пневмококков.
   3. Для количественной оценки прикрепления бактерий к строкам VWF остановите поток и создайте снимки Z-стеков, состоящих по крайней мере из 30 репрезентативных полевых представлений, каждый из которых содержит примерно 10 морфологически неповрежденных HUVEC, и подсчитайте количество пневмококков.
   4. Используйте алгоритм однофакторной статистики ANOVA для оценки данных, за которым следует апостериорный тест на основе двусторонней непарной выборки для детального статистического сравнения. Значения P в размере <0,05 считались статистически значимыми.

Материалы