Флуоресцентная визуализация бактериальной инфекции, ассоциированной с биоматериалом, у эмбрионов рыбок данио

Аннотация

Источник: Zhang, X., et al. Модель эмбриона рыбки данио для визуализации in vivo и прижизненного анализа инфекции Staphylococcus aureus , ассоциированной с биоматериалом. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется флуоресцентная визуализация эмбрионов рыбок данио, которым был введен золотистый стафилококк, что позволяет количественно оценить прогрессирование инфекции и распределение бактерий для оценки влияния микросфер биоматериала на взаимодействие хозяина и патогена in vivo.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Флуоресцентная микроскопия прогрессирования инфекции и спровоцированной инфильтрации клеток у эмбрионов рыбок данио

1. Обезболите эмбрионы, поместив их в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 0,02% (w/v) 3-аминобензойной кислоты (трикаин) для анестезии. Через 5 минут перенесите эмбрионы в агарозную пластину, покрытую средой Е3, содержащей 0,02% (по объему) трикаина, и выровняйте их в одной ориентации для инъекции. Пипеткой внесите 500 мкл PBS (фосфатно-солевого буфера)-2% (масс.) раствора метилцеллюлозы в чашку Петри, содержащую среду Е3 с 0,02% (мас./об.) трикаина. Поместите эмбрионы в раствор метилцеллюлозы и держите их прямо и горизонтально.
   ЗАМЕТКА: В качестве «клея» используется раствор метилцеллюлозы, который благодаря своей вязкости может временно обездвижить эмбрионы в наилучшей ориентации для визуализации.
2. Используйте стереофлуоресцентный микроскоп, оснащенный фильтрами bright field, mCherry, зеленым флуоресцентным белком (GFP) и УФ-(ультрафиолетовым) фильтрами для получения изображений отдельных эмбрионов при идентичных оптимизированных настройках (например, интенсивности, усилении и времени экспозиции) при 160-кратном увеличении. Установите фокальную плоскость таким образом, чтобы повреждение тканей, вызванное инъекцией, было в фокусе, используя фильтр светлого поля. Установите глубину Z-стека на 10 мкм и размер шага на 5 мкм, что позволит записать 3 последовательных изображения.
3. Визуализируйте отдельные эмбрионы один раз в день в течение 5 часов после инъекции до 2 дней после инъекции. Исключите мертвые эмбрионы (без сердцебиения или с частичной деградацией эмбриона) для дальнейшей визуализации и анализа. Выращивайте эмбрионы индивидуально в среде Е3 в 48-луночных планшетах. Ежедневно обновляйте среду.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микросферы из полистирола диаметром 10 мкм (синие флуоресцентные)	Технологии жизни/ThemoFisher	Ф8829
3-аминобензойная кислота (трикаин)	Сигма-Олдрич	Э10521-50Г
Стереофлуоресцентный микроскоп LM80	Лейка	MDG3610450126
Метилцеллюлоза 4000cp	Сигма-Олдрич	МО512-250Г
Чашка Петри	Сокол	353003
Чашка Петри	Биомерье	НЛ-132
ИзображениеJ	Не применимо	Не применимо	ссылка: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
ГрафПад 7.0	Призма	Не применимо