Анализ in vivo бактериальных инфекций, ассоциированных с имплантатами, с использованием эмбрионов рыбок данио

Аннотация

Источник: Zhang, X. et al., Модель эмбриона данио-рерио для визуализации in vivo и прижизненного анализа инфекции Staphylococcus aureus , ассоциированной с биоматериалом. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется модель эмбриона рыбки данио для изучения инфекций, связанных с имплантированными биоматериалами. Инъекции Staphylococcus aureus микросфер из полистирола повышают выживаемость бактерий, подтверждая роль имплантируемых материалов в продвижении инфекций.

Протокол

1. Приготовление суспензий только на основе бактерий и бактерий-микросфер

ЗАМЕТКА: Используется штамм Staphylococcus aureus RN4220, экспрессирующий флуоресцентный белок mCherry (S. aureus-mCherry). Штамм S. aureus RN4220 мутировал в гене регулятора вирулентности agrA (дополнительный регулятор гена A), и, следовательно, может иметь относительно низкую вирулентность в модели эмбриона данио-рерио. Могут быть использованы другие штаммы S. aureus или другие виды бактерий для борьбы с биоматериал-ассоциированной инфекцией (БАИ).

1. Возьмите от 4 до 5 колоний бактерий S. aureus RN4220 из триптических соевых агаровых планшетов с добавлением 10 мкг/мл хлорамфеникола и культивируйте бактерии до среднелогарифмической фазы роста в 10 мл триптического соевого бульона с добавлением 10 мкг/мл хлорамфеникола при 37 °С при встряхивании.
   1. Во время культивирования разведите 100 мкл бактериальной суспензии в 900 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) в кювете (ширина 1 см) для измерения оптической плотности (OD) при длине волны 620 нм (OD₆₂₀). Культивируйте бактерии до тех пор, пока наружный диаметр₆₂₀ не достигнет 0,4–0,8.
      ЗАМЕТКА: Наружный диаметр₆₂₀ 0,1 обычно соответствует 3,0 x 10⁷ колониеобразующей единицы (КОЕ)/мл S. aureus. OD₆₂₀ инокулюма бактерий в среднелогарифмической фазе роста составляет 0,4-0,8. Для других видов и штаммов бактерий могут потребоваться разные временные периоды для культивирования.
2. Центрифугируйте бактерии при давлении 3 500 x g в течение 10 мин и повторно суспендируйте гранулированные бактерии в 1 мл стерильного PBS. Затем промойте бактерии стерильным PBS 2 раза, и, наконец, повторно суспендируйте бактерии в 1,1 мл 4% (w/v) раствора поливинилпирролидона40 (PVP40) в PBS.
3. Вортексируйте эту бактериальную суспензию и разведите 100 мкл суспензии в 900 мкл стерильного PBS в кювете для измерения наружного диаметра₆₂₀ . Отрегулируйте концентрацию бактериальной суспензии раствором ПВП40. Это суспензия "Только для бактерий".
4. Биоматериалы можно свободно выбирать для смешивания с бактериальной суспензией. В настоящем исследовании используются микросферы из коммерческого полистирола (ПС) (синие флуоресцентные, 10 мкм). Чтобы получить суспензию бактерий-микросфер, центрифугируйте микросферы в течение 1 мин при 1000 x g при комнатной температуре, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте микросферы в суспензии «Только для бактерий» (в растворе PVP40).
5. Для того чтобы вводить примерно равные дозы бактерий в присутствии и при отсутствии микросфер, концентрация суспензии «Бактерии-микросферы» должна составлять две трети от концентрации суспензии «Только для бактерий» (без микросфер). Это достигается за счет разбавления суспензии «Бактерии-Микросферы» 0,5 объема раствора ПВП40. Перемешайте суспензии путем вортексирования. Следует отметить, что это соотношение (две трети) было оценено для S. aureus. Оно также подходит для S. epidermidis, но рекомендуется проверить, относится ли это соотношение также к другим видам бактерий и другим размерам (более 10 мкм) или формам биоматериалов (чем микросферы), которые будут вводиться.
6. Проверьте концентрацию суспензии «Только для бактерий» и «Бактерии-микросферы» путем количественного культивирования 10-кратных серийных разведений, как показано ниже: перенесите 100 мкл суспензии в 96-луночный планшет и последовательно разбавьте, переложив 10 мкл аликвот суспензии в 90 мкл стерильного PBS. Планшет дублируют 10 мкл аликвот неразбавленных и разбавленных суспензий на агарозных планшетах, инкубируют планшеты при 37 °С в течение ночи, подсчитывают колонии и рассчитывают количество бактерий (колониеобразующих единиц, КОЕ).

2. Разведение, сбор и содержание эмбрионов данио-рерио

1. Следуйте общим процедурам разведения, сбора и содержания эмбрионов данио-рерио с изменениями, описанными ниже. Скрестите семейство длинноплавниковых рыбок Тупфеля дикого типа (TL) данио или данио-рерио выбранной трансгенной линии (здесь, Mpeg1: Kaede) в аквариуме с добавленной сеткой, чтобы побудить взрослых самок произвести икру после включения света, а затем отделите взрослых особей от произведенных икринок.
2. На следующий день соберите эмбрионы и выбросьте непрозрачные, которые не жизнеспособны. В каждой чашке Петри (100 мм в диаметре) содержится около 60 эмбрионов в среде Е3 и инкубация при 28 °C. Мертвые и аномальные эмбрионы удаляются и ежедневно обновляются в среде Е3.

3. Подготовка инъекционных игл

1. Подготовьте стеклянные микрокапиллярные иглы к инъекции с помощью инструмента для вытягивания микропипетки. Используйте следующие настройки: нагрев: 772, тяга: 100, вел: 200, время: 40, газ: 75.
2. Сломайте кончик иглы щипцами в том месте, где внешний диаметр иглы составляет примерно 20 мкм (для микросфер 10 мкм), используя световой микроскоп с масштабной линейкой в окуляре. Избегайте игл с очень большим размером отверстия, так как они поставят под угрозу выживание эмбрионов.
   ЗАМЕТКА: Отверстие может быть выбрано меньше или больше, в зависимости от размера и формы вводимых биоматериалов. В литературе сообщалось, что инъекции с использованием игл с отверстием примерно 50 мкм вызывают значительное снижение выживаемости эмбрионов.

4. Введение суспензии только бактерий или бактериальных микросфер эмбрионам рыбок данио

1. Раствор агарозы (1–1,5% (масс.) в полуводе) подогреть в микроволновой печи и вылить в 100-мм чашку Петри. Поместите пластиковый шаблон формы поверх раствора агарозы в чашке Петри, чтобы создать углубления в агарозе для размещения эмбрионов в правильных положениях и облегчения инъекций. Инкубируйте при комнатной температуре и удалите плесень, когда раствор агарозы застынет.
2. Через 3 дня после оплодотворения поместите эмбрионы в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 0,02% (w/v) 3-аминобензойной кислоты (трикаин) для их обезболивания. Через 5 минут перенесите эмбрионы в агарозную пластину, покрытую средой Е3, содержащей 0,02% (по объему) трикаина, и выровняйте их в одной ориентации для инъекции. Для трансгенной линии Mpeg1: Kaede сначала обезболивают эмбрионы в среде Е3, содержащей 0,02% (w/v) трикаина. Затем выберите эмбрионы, экспрессирующие зеленые флуоресцентные белки, с помощью стереофлуоресцентного микроскопа.
3. Загрузите в иглу примерно 10 μL суспензии «Bacteria-only» или «Bacteria-Microspheres» с помощью наконечника для пипетки с микрозагрузчиком. Установите иглу на микроманипулятор, подключенный к микроинжектору. Для используемого здесь инжектора (см. Таблицу материалов) используйте следующие настройки для инъекций 2–3 нл: давление: 300–350, противодавление: 0, время: 2 мс. ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки микроинжектора зависят от используемого инжектора. Возможно, потребуется отрегулировать настройки инжектора для инъекций бактерий, смешанных с биоматериалами других форм или размеров.
   1. Используйте иглы с одинаковым отверстием для инъекций суспензии «Только для бактерий» и суспензии «Бактерии-микросферы». Если игла сломана или забита, всегда меняйте иглу на новую для дальнейших инъекций.
4. Введите иглу в мышечную ткань эмбрионов под световым микроскопом (рисунок 1), под углом 45–60° между иглой и телом эмбрионов. Отрегулируйте положение иглы в ткани, аккуратно двигая ее вперед и назад. Вводите эмбрионы с помощью ножной педали, подключенной к микро-инжектору.
5. После инъекции флуоресцентных бактерий оцените эмбрионы на успешную инфекцию под стереофлуоресцентным микроскопом. Отбракуйте эмбрионы с отрицательным результатом (без видимых флуоресцентных бактерий или видимых флуоресцентных микросфер). Выращивайте эмбрионы индивидуально в среде Е3 в 48-луночных планшетах. Ежедневно обновляйте среду.

5. Дробление эмбрионов, микроскопическая оценка и количественное культивирование бактерий

1. Оценивайте все эмбрионы под микроскопом на наличие флуоресцентных бактерий с помощью стереофлуоресцентного микроскопа, начиная сразу после инъекций и в каждый последующий день до тех пор, пока эмбрионы не будут случайным образом выбраны для количественного посева.
2. Случайным образом выберите несколько живых инфицированных эмбрионов (от 5 до 6 в настоящем исследовании) вскоре после инъекции и перенесите их по отдельности в микропробирки объемом 2 мл с использованием стерильных наконечников. Удалите среду, аккуратно промойте эмбрионы стерильным PBS один раз и добавьте 100 μL стерильного PBS.
3. Добавьте 2–3 стерильных шарика диоксида циркония (диаметром 2 мм) в каждый флакон и измельчите эмбрионы с помощью гомогенизатора (см. Таблицу материалов) при 3 500 об/мин в течение 30 с. Культивируйте гомогенат количественно, как описано в шаге 1.3.
   ЗАМЕТКА: Для других гомогенизаторов могут потребоваться другие настройки.
4. В последующие дни после инъекции случайным образом отбирают несколько эмбрионов для количественного посева в соответствии с шагом 5.3.

Результаты

Рисунок 1: Схематическая процедура совместного введения суспензии бактерий-микросфер в хвостовую мышцу эмбрионов рыбок данио.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Триптический соевый агар	BD Difco	236950	Блок подготовки медиаматериалов в AMC
Триптический соевый бульон	BD Difco	211825
Поливинилпирролидон40	Апплименем	А2259.0250
Микросферы из полистирола диаметром 10 мкм (синие флуоресцентные)	Технологии жизни/ThemoFisher	Ф8829
Стеклянный микрокапиллярный (внешний диаметр 1 мм x внутренний диаметр 0,78 мм)	Гарвардский аппарат	30-0038
Инструмент для вытягивания микропипеток	Саттер Инструмент Инк	Пылающий-97
Световой микроскоп LM 20	Лейка	ЦРТ33 10450123
3-аминобензойная кислота (трикаин)	Сигма-Олдрич	Э10521-50Г
Агароза МП	Рош	11388991001
Стереофлуоресцентный микроскоп LM80	Лейка	MDG3610450126
Наконечники для пипеток микрозагрузчика	Эппендорф	5242956.003
Микроманипулятор M3301 со стойкой M10	Мировые прецизионные приборы	00-42-101-0000
Микроинжектор FemtoJet express	Эппендорф	5248ЗО100329
Микротруб 2мл pp	Сарштедт	72.693.005
Бусины из диоксида циркония	Био-коннект	11079124ZX
Лизер MagNA	Рош	41416401
Хлорамфеникол	Сигма-Олдрич	С0378
Гироторный шейкер (для роста бактерий)	Научный центр Нью-Брансуика	Г10
Инкубатор для рыбок данио рерио	ВВР	Инку-лайн
Кюветы	КЛЕЙМО	759015
Центрифуга	Hettich-Zentrifugen	РОТАНТА 460Р
Спектрометр	Фармация биотех	Ультроспек®2000
Щипцы	Сигма-Олдрич	Ф6521-1ЭА
48 колодезных пластин	Грайнер биоуан	677180
96 колодезных пластин	Грайнер биоуан	655161
Чашка Петри	Сокол	353003
Чашка Петри	Биомерье	НЛ-132