Чувствительный визуальный метод для обнаружения бактерий, продуцирующих сероводород

Аннотация

Источник: Чжу, В., и Чу, В. Чувствительный визуальный метод для обнаружения бактерий, продуцирующих сероводород. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется чувствительный визуальный метод для быстрого обнаружения бактерий, продуцирующих сероводород. Изменение цвета с желтого на черный указывает на активность бактерий за счет образования сульфида висмута.

Протокол

1. Штаммы бактерий

ЗАМЕТКА: Для этого эксперимента использовали девять стандартных штаммов, в том числе Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris и Klebsiella pneumoniae. Сальмонелла паратифи A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa и Proteus vuigaris могут продуцировать_H2S.

1. Подготовка бактериального посева
   1. Перенесите одну колонию бактерий Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 и Klebsiella pneumoniae из агарового планшета Лурия-Бертани (LB) в 100 мл среды LB и культивируйте при 37 °C в течение 12-16 ч до тех пор, пока концентрация бактерий не составит около 1 x 10⁹ клеток/мл (как указано в OD₆₀₀ = 1).
   2. Перенесите одну колонию бактерий Fusobacterium nucleatum и Proteus vuigaris из агаровых планшетов триптиказы соевого бульона (TSB) в 100 мл среды TSB и культивируйте при 37 °C анаэробно в течение 24 ч до тех пор, пока концентрация бактерий не составит около 1 x 10⁹ клеток/мл (как указано OD₆₀₀ = 1).

2. Анализ обнаружения H₂S

1. Испытание производства сероводорода
   1. Смешайте 100 мкл бактериальной культуры со 100 мкл вновь приготовленного раствора висмута (pH 8,0; 10 мМ хлорида висмута (III), 0,4 М триэтаноламина-HCl, 20 мМ пиридоксаль-5-фосфата моногидрата, 20 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) и 40 мМ L-цистеина) в 96-луночных микротитровальных планшетах и культуре в течение 20 мин при 37 °C. Для каждого штамма бактерий выполняйте анализ в трех экземплярах.
   2. Через 20 минут проверьте изменение цвета. Если цвет раствора меняется со светло-желтого на черный, это говорит о том, что бактерия способна вырабатывать H₂S. Повторите это измерение 3 раза.
2. Чувствительность метода
   1. Определяют чувствительность метода с использованием различных концентраций гидросульфида натрия (NaHS): 2 мМ, 1 мМ, 0,8 мМ, 0,6 мМ, 0,4 мМ, 0,2 мМ, 0,1 мМ и 0 мМ, смешанных с раствором BS (сульфида висмута).
   2. Определите наличие HS⁻/S²⁻ , наблюдая за образованием черного осадка BS. Оцените цвет лунок с помощью визуальной шкалы от отсутствия цвета (-) до самого темного черного цвета (++++++).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хлорид висмута (III)	Шанхайская биохимическая компания Macklin Co., Ltd	7787-60-2
ЭДТА	Нанкинская химическая реагентная компания Co., Ltd	60-00-4
Fusobacterium nucleatum	АТКС	25586
L-цистеин	Амреско	52-90-4
Триэтаноламин-гидрохлорид	Шанхай Аладдин Биохимическая Технология Ко., Лтд.	637-39-8
Гидросульфид натрия
Пипетка