Приготовление одноклеточного бактериального посева

Аннотация

Источник: Ню, Л., и др., Визуализация гибели литических клеток макрофагов во время микобактериальной инфекции у эмбрионов рыбок данио-рерио с помощью прижизненной микроскопии. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется приготовление суспензии одиночных клеток Mycobacterium marinum из культуры поздней логарифмической фазы для последовательного использования в анализах на инфекции и последующем применении.

Протокол

1. Препарат инокулята одиночных клеток Mycobacterium marinum (Рисунок 1)

1. Разморозьте церулеан-флуоресцентный глицериновый запас Mycobacterium marinum с -80 °C и инокулируйте агаровую пластину 7H10 10% (v/v) OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза, каталаза), 0,25% глицерина и 50 мкг/мл гигромицина. Инкубируйте планшет при температуре 32 °C в течение примерно 10 дней.
2. Выберите колонию с положительной флуоресценцией и инокулируйте 3 мл среды 7H9 с 10% OADC, 0,5% глицерина и 50 мкг/мл гигромицина.
   1. Инкубируют инокуляцию при 32 °C и 100 оборотах в минуту (об/мин) в течение 4–6 дней, пока культура не достигнет логарифмической фазы (OD₆₀₀ = 0,6–1,0).
   2. Субкультура (1:100) в 30 мл свежей среды 7H9 с 10% OADC, 0,5% глицерина, 0,05% Tween-80 и 50 мкг/мл до тех пор, пока OD₆₀₀ не достигнет ~1,0.
      ЗАМЕТКА: На этом этапе рекомендуется этап субкультуры для достижения наивысшего качества культуры. По нашему опыту, добавление клона непосредственно в большой объем среды приведет к образованию бактериальных комков.
3. Соберите клетки M. marinum , как описано ниже.
   1. Центрифугируйте при давлении 3 000 x g в течение 10 минут, чтобы собрать M. marinum в виде гранул. Выбросьте все надсадочную жидкость, кроме 300 μл, и используйте ее для повторного суспендирования гранулы.
   2. Добавьте 3 мл среды 7H9 с 10% глицерином для дальнейшей ресуспендирования гранулы, затем обработайте суспензию ультразвуком на водяной бане при 100 Вт при 15 с ВКЛ, 15 с ВЫКЛ в общей сложности 2 мин.
      ЗАМЕТКА: Ультразвуковая обработка используется для получения гомогената одиночных клеток для посевного материала, который предотвращает блокировку иглы для микроинъекций.
4. Перелейте бактериальную суспензию в шприц объемом 10 мл и пропустите ее через фильтр 5 мкм для удаления комков.
5. Измерьте оптическую плотность (OD) суспензии с помощью спектрофотометра и разбавьте ее до OD₆₀₀ = 1,0 средой 7H9, содержащей 10% глицерина. Разделите суспензию на 10 мкл аликвот и храните при температуре -80 °C в морозильной камере впрок.
6. Подтвердите бактериальную концентрацию инокулюма (КОЕ/мл) путем серийного разведения и нанесения бактериального материала на агаровую пластину 7H10, содержащую 10% (v/v) OADC, 0,5% глицерина и 50 мкг/мл гигромицина.

Результаты

Рисунок 1: Принципиальная схема получения одноклеточных бактерий. Одноклеточные церулеан-флуоресцентные запасы Mycobacterium marinum были получены в соответствии с описанным процессом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,05% Твин-80	Сигма	П1379
Шприц 10 мл	Соларбио	Я0552
10% OADC	БД	211886
Фильтр 5 мкм	Милле Х	SLSV025LS
50 мкл/мл гигромицина	Сангон Биотех	A600230
7Н10	БД	262710
7Н9	БД	262310
Камера окружающей среды	Пекон	Контроль температуры 37-2 цифровой
Микрозагрузчик Eppendorf	Эппендорф	No5242956003
Глицерин	Сангон Биотех	A100854
Инкубатор	Килрейн	РН-140(А)
Mycobacterium marinum			АТКС БАА-535
Ультразвуковой аппарат	SCICNTZ	JY92-IIDN
Спектрофотометр (OD600)	Eppendorf AG	22331 Гамбург