Получение цитотоксических амилоидов после бактериальной инфекции эндотелиальных клеток легочной артерии крыс

Аннотация

Источник: Balczon, R., et al. Методы обнаружения цитотоксических амилоидов после инфицирования эндотелиальных клеток легких Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео показана процедура получения цитотоксического надосадочной жидкости из эндотелиальных клеток легких после инфицирования Pseudomonas aeruginosa. В нем описывается, как бактериальные эффекторные белки нарушают структуру клетки-хозяина и индуцируют высвобождение цитотоксических амилоидных олигомеров в надосадочную жидкость.

Протокол

1. Генерация цитотоксических надосадочных жидкостей:

Первичные культуры микрососудистых эндотелиальных клеток легких крыс (PMVECs) были получены из Центра клеточных культур Центра биологии легких Университета Южной Алабамы.

1. Для получения цитотоксических надосадочных жидкостей поместите 2 x 10⁶ клеток в отдельные 150-сантиметровые чашки и выращивайте в течение 3 - 4 дней до достижения слияния. Используйте две пластины для каждого эксперимента.
2. Для выработки надосадочной жидкости необходимо вымыть одну из двух 150-см посуды ПМВЭК с фосфатно-солевым буфером, провести трипсинизацию, а затем посчитать клетки. Вымойте другую чашку PMVEC сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS), а затем заразите любым из штаммов Pseudomonas aeruginosa при кратности инфекции (MOI) 20:1. Это достигается следующим образом:
   1. Для P. aeruginosa, наружный диаметр₅₄₀ 0,25 = 2 x 10⁸ КОЕ/мл. Чтобы приготовить это разведение, добавьте 1 мл HBSS в одноразовую кювету объемом 1 мл. Соскребите достаточное количество бактерий с планшета до тех пор, пока при измерении с помощью спектрофотометра не будет достигнут внешний диаметр₅₄₀ 0,25. На следующем шаге будет сделан расчет того, сколько бактерий понадобится.
   2. После определения количества PMVEC в чашке для культивирования определите соответствующее количество бактерий, которые должны быть добавлены во вторую, нетрипсинизированную чашку для культур, содержащую PMVEC. Например, если определено, что культуральная чашка PMVEC содержит 1,3 x 10⁷ клеток, то приготовьте 1,3 x 10⁷ клеток x 20 бактерий/клетка x 1 мл/2 x 10⁸ КОЕ = 1,3 мл бактерий.
   3. Разведите 1,3 мл бактерий в HBSS до конечного объема 20 мл, чтобы вся поверхность посуды длиной 150 см могла быть покрыта жидкостью, затем добавьте разведенные бактерии в тарелку PMVEC.
   4. Инкубируйте инокулированные с бактериями PMVEC при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение 4-5 часов до тех пор, пока при микроскопическом наблюдении за планшетом в монослое клетки не появятся промежутки (см. Рисунок 1 для определения правильного уровня образования щелей).
   5. Соберите надосадочную жидкость, затем центрифугируйте в течение 10 минут при давлении 2000 x g в настольной центрифуге для удаления клеточного мусора.
      Заметка: Для этого этапа можно использовать любую настольную центрифугу, способную генерировать достаточную силу перегрузки для гранулирования нелизированных клеток и крупных фрагментов клеток.
   6. Налейте надосадочную жидкость в шприц, к концу которого прикреплен фильтр 0,2 мкм, затем пропустите надосадочную жидкость через фильтр для удаления бактерий.
   7. Используйте аликвоту стерильного надосадочной жидкости для проверки цитотоксичности и заморозьте оставшуюся часть надосадочной жидкости при температуре -80 °C для использования в будущем.

Результаты

Рисунок 1. Влияние инокуляции P. aeruginosa на морфологию PMVEC. Сливающийся монослой PMVEC до (А) и через четыре часа после добавления (В) штамма PA103 P. aeruginosa. В инфицированных клетках отчетливо видны пробелы в клеточном м...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
HBSS	Gibco	14025-092
ПБС	Gibco	10010-023
Шприцевые фильтры 0,22 микрона	Многородность	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
Автоматизированный счетчик ячеек Countess	Инвитроген	С10277
Концентраторы микроцетрифугации - отсечка 10 000 МВт	Многородность	UFC801008
Штаммы PA103 и ΔPcrV			Эти штаммы P. aeruginosa были получены от доктора Дары Франк из Медицинского колледжа Университета Висконсина, Милуоки, штат Висконсин
Агар	Рыбак	БП1423-500
Фетальная бычья сыворотка	Гиклон	SH30898.03IH
ПенСтрептококк	Gibco	15070063