Введение гена в клетку является мощным средством для выяснения его функции в живом организме. Этот протокол описывает эффективный метод трансфекции культуры человека нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) с использованием аппарата Nucleofector электропорации сделанные Amaxa.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трансфекции правам нервные стволовые клетки с Amaxa Nucleofector
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Трансфекция первичных нервных клеток млекопитающих, таких как человеческий нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs), с часто используемыми катионных реагентов трансфекции липидного часто приводит к ухудшению жизнеспособности клеток и низкой эффективности трансфекции. Другие механические способы введения гена, таких, как пушка гена или микроинъекции, также ограничены плохой выживаемости клеток и небольшого числа трансфекции клеток. Стратегия использования вирусных конструкций ввести экзогенных генов в первичных клеток сдерживается как количество времени и труда, необходимые для создания вирусных векторов и потенциальные проблемы безопасности. Мы описываем здесь шаг за шагом протокол для трансфекции hNSPCs использованием Nucleofector устройство Amaxa и технологии с электрическим током параметров и буферных растворов, специально оптимизированных для трансфекции нервные стволовые клетки. Используя этот протокол, мы достигли начальной эффективности трансфекции ~ 35% и ~ 70% после стабильной трансфекции. Протокол подразумевает объединение большого числа hNSPCs с ДНК для трансфекции в соответствующий буфер следуют электропорации с Nucleofector устройства.
Протокол
Примечание: Обратитесь к пассажей правам нейронных стволовых клеток статьи ( https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) и подсчет правам нейронных стволовых клеток статьи ( https://www.jove.com / индекса / Details.stp? ID = 262 ), чтобы узнать, как ресуспендирования и считать hNSPCs.
Подготовка
- Убедитесь, что Есть много клеток для трансфекции (несколько миллионов клеток для каждого ДНК для трансфекции).
- Пальто блюдо культуры тканей, в которые трансфекции клетки будут посеяны, с 10 мкг / мл человеческого фи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает сравнительно быстрого и эффективного трансфекции процедура hNSPCs. Используя эту процедуру, мы получили начальные эффективность трансфекции ~ 35%. Клетки трансфекции с помощью этой процедуры можно использовать для краткосрочных исследованиях (временно трансфекции клеток) или для долгосрочного исследования, если выбор агента используется для создания стабильно трансфицированных населения. Мы вызвали стабильно трансфицированных клеток, в которых ~ 70% от клетки экспрессируют экзогенных белков. В временно трансфекции hN.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность д-р Филип Х. Шварца о человеческом нейронных стволовых клеток ресурсов в Детской больнице с, Orange County научно-исследовательский институт для обеспечения hNSPC культур.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Прибор Nucleofector | Инструмент | Amaxa | AAD-1001 | |
| Набор для нуклеофекции нейральных стволовых клеток мыши | Реагент | Amaxa | VPG-1004 |
Ссылки
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
