Отслеживание динамики бактериальной инфекции у мыши с помощью биолюминесценции

Аннотация

Источник: Valentine, M. E., et al. Генерация мутантов делеции гена в кадре у Pseudomonas aeruginosa и тестирование на ослабление вирулентности в простой мышиной модели инфекции. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео демонстрируется использование биолюминесценции для визуализации и сравнения in vivo поведения вирулентных и ослабленных бактериальных штаммов у мышей. В ней описан процесс приготовления биолюминесцентных бактериальных суспензий и их внутрибрюшинного введения мышам. Вирулентный штамм демонстрирует системное распространение, в то время как ослабленный штамм остается локализованным и постепенно очищается, на что указывает сигнал затухания.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Инокуляция животных штаммами бактерий путем инъекции
   1. Утром в день инъекции удалите криовиалы исследуемых штаммов бактерий и разморозьте при 4 °C в течение 3-4 ч. Разморозьте 0,5 мл для каждой мыши, которая будет введена инъекцией. После размораживания флаконы держать на льду и вводить мышам в течение 2 ч.
   2. После размораживания перенесите каждый криовиал в новую пробирку объемом 2 мл и центрифугируйте при 4500 x g в течение 10 минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл 1x PBS (фосфатно-солевой буфер).
   3. Снова центрифугируйте при давлении 4 500 x g в течение 10 минут. Отбраковать надосадочную жидкость и ресуспендировать гранулы в 1x PBS до конечной концентрации 2,5 x 10⁹ КОЕ/мл (КОЕ: колониеобразующие единицы). Точное количество используемого 1x PBS будет немного варьироваться в зависимости от штамма.
      1. Возьмите 3 образца из окончательной суспензии каждого штамма для валидации КОЕ/мл, генотипа и фенотипа, как описано выше.
   4. Для каждого штамма необходимо ввести 1,5 мл PBS/клеточной суспензии в одну пробирку объемом 2 мл на 5 мышей, чтобы ограничить количество вводов в пробирку. Также подготовьте пробирки 1x PBS для контрольных инъекций.
   5. Соберите мышей (10 самцов и 10 самок C57BL/6 на группу для этого эксперимента) и материалы, необходимые для инъекций (шприцы, иглы, контейнеры для острых предметов, маркеры, ручку, бумагу и т. д.). Переместитесь в стерильную хирургическую комнату для животных. Протрите все поверхности дезинфицирующими салфетками.
      1. Чтобы исключить стресс и риск травмирования экспериментатора, приводите в операционную только одну группу мышей одного пола и экспериментальную группу за один раз (например, группу из 10 самцов мышей, которые должны быть инфицированы определенным штаммом). Наденьте две пары латексных перчаток, чтобы исключить прокол перчаток в случае укуса. Наденьте лабораторный халат, защитные очки и маску для лица, чтобы избежать загрязнения.
   6. Начните инъекции контрольной группы с 1x PBS. Это позволит установить, возникают ли какие-либо побочные эффекты только от инъекции.
      1. Выньте мышь из клетки. Удаляйте только одну мышь за раз.
      2. Взвесьте мышь и отметьте ее хвост постоянным маркером, чтобы отслеживать потерю веса после инъекции.
      3. Откройте новый шприц объемом 1 мл и иглу 27 г (используйте новый шприц и иглу для каждой мыши для устранения загрязнения) и введите 200 мкл стерильного 1x PBS.
         1. Захватите мышку за уши с помощью большого и указательного пальцев. Сощипьте, чтобы создать кожную складку на затылке, за которую можно держаться - более плотная складка уменьшает движение шеи и риск укуса во время инъекции. Закрепите хвост на ладони с помощью мизинца, чтобы удерживать мышь горизонтально с небольшим движением.
         2. Переверните мышь и введите иглу под углом 30° в брюшную полость слева или справа от средней линии. Слегка приподнимите иглу после введения, чтобы убедиться, что она введена во внутрибрюшинную область, а не в органы. Медленно введите PBS, а затем извлеките иглу.
         3. Поместите использованную иглу в специальный контейнер для биологически опасных острых предметов. Не используйте шприц или иглу повторно. Типичным является комок в месте инъекции.
      4. После инъекции переместите мышь в отдельную клетку.
      5. Повторите процедуру со следующей мышкой. После того, как все мыши одной клетки будут введены инъекции, немедленно верните их в исходную клетку.
   7. После введения в контрольную группу начинают вводить суспензии штаммов, подлежащих испытанию, следуя той же процедуре.
      1. Введите 200 мкл клеточной суспензии. При использовании клеточных суспензий 2,5 x 10⁹ КОЕ/мл каждая мышь получает 5 x 10⁸ КОЕ.
         ЗАМЕТКА: Эти концентрации были оптимизированы с помощью предварительных исследований на животных для определения смертельных доз каждого штамма. Возможно, потребуется скорректировать дозировку для других штаммов/видов.
   8. После того, как все инъекции будут завершены, верните мышей в помещение, чтобы облегчить стресс. Очистите рабочее место дезинфицирующими салфетками.
   9. Контролируйте смертность животных после инъекции, проверяя клетки на наличие мертвых мышей каждые 3 ч в течение 72 ч и каждые 12 ч в течение 10 дней. Записывайте вес мышей каждые 12 часов, чтобы определить потерю веса из-за болезни.

Материалы