Получение рекомбинантов Pseudomonas aeruginosa с двойным кроссинговером для таргетной делеции гена

Аннотация

Источник: Valentine, M. E., et al. Генерация мутантов делеции гена в кадре у Pseudomonas aeruginosa и тестирование на ослабление вирулентности в простой мышиной модели инфекции. J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео демонстрируется генерация рекомбинантов с двойным кроссинговером у Pseudomonas aeruginosa с использованием стратегии делеции генов на основе плазмид. Процесс включает в себя отбор бактерий, которые содержат нерепликативную плазмиду, интегрированную в геном посредством одного кроссинговера, а затем индуцирование второго события рекомбинации под действием отбора сахарозы для вырезания плазмиды. Успешная рекомбинация с двойным кроссинговером подтверждается потерей устойчивости к антибиотикам и способности к росту на сахарозосодержащих средах.

Протокол

1. Обнаружение рекомбинантов P. aeruginosa с двойным скрещиванием

1. Для каждой культуры бульона инокулируйте 10 мкл культуры на предварительно подогретую пластину PIA (Pseudomonas Isolation Agar) с добавлением 10% сахарозы (без глицерина) и прожилки для изолированных колоний. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 °C.
2. На следующий день достаньте пластины из инкубатора и осмотрите их на предмет роста. Колонии, устойчивые к сахарозе, должны быть рекомбинантами с двойным кроссинговером (т.е. удалить плазмиду из хромосомы в результате рекомбинации между другим гомологичным участком плазмидного вкладыша и хромосомой P. aeruginosa ).
   1. Наложите не менее 20 колоний стерильными зубочистками на предварительно подогретые пластины: 1) ПИА, 2) ПИА с добавлением 10% сахарозы (без глицерина) и 3) ПИА с добавлением 300 мкг/мл карбенициллина.
3. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 °C.
4. Достаньте пластины из инкубатора и осмотрите их на предмет роста. Настоящие рекомбинанты с двойным кроссинговером будут чувствительны к карбенициллину и устойчивы к сахарозе (т.е. колонии, которые выросли на PIA и PIA с добавлением сахарозы, но не выросли на PIA с добавлением карбенициллина).

Материалы