Получение и выделение спор Streptomyces venezuelae из жидкой культуры

Аннотация

Источник: Schlimpert, S., et al. Флуоресцентная покадровая визуализация полного жизненного цикла S. venezuelae с использованием микрофлюидного устройства. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео показано выращивание и выделение спор из Streptomyces venezuelae. Споры, спящие клетки, которые помогают бактериям пережить стресс, образуются во время ограничения питательных веществ и собираются с помощью центрифугирования. Этот метод обеспечивает получение чистой суспензии спор холодного хранения для последующих применений.

Протокол

1. Выделение свежих спор Streptomyces venezuelae и приготовление отработанной питательной среды

1. Инокулируйте 30 мл среды мальтозно-дрожжевого экстракта солодового экстракта (MYM) с добавлением 60 мкл раствора микроэлемента R2 (TE) с 10 мкл спор штамма SV60 [attBφBT1::p SS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]. Для постоянного роста и спорообразования клеток используйте колбу с перегородкой или колбу с пружиной, обеспечивающей достаточную аэрацию.
2. Культивирование клеток в течение 35-40 ч при 30 °C и 250 об/мин.
3. Исследуйте клетки с помощью жидкостной фазово-контрастной микроскопии. На этом этапе будут видны фрагменты мицелия и споры.
4. Центрифугируйте 1 мл клеток в настольной центрифуге при давлении 400 x g в течение 1 минуты для гранулирования мицелия и более крупных фрагментов клеток.
5. Перенесите примерно 300 мкл надосадочной жидкости, содержащей суспензию спор, в новую пробирку объемом 1,5 мл и держите на льду. Храните оставшуюся питательную среду
6. Разведите споры в соотношении 1:20 в MYM-TE (конечная концентрация: 0,5-5 x 10⁷ спор/мл) и держите на льду до тех пор, пока не понадобится.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя точные условия, которые вызывают споруляцию у Streptomyces , не изучены, использование отработанной среды MYM-TE, включая любые неизвестные внеклеточные сигналы от спорулирующей культуры, стимулирует спорообразование.
7. Отфильтровать и стерилизовать 10 мл оставшейся питательной среды до получения отработанного MYM-TE, свободного от спор и фрагментов мицелия. Используйте стерильный шприц-фильтр 0,22 мкм и перенесите отработанный MYM-TE в стерильную пробирку объемом 15 мл.
8. Подготовленный отработанный МИМ-ТЭ выдерживают в течение нескольких дней при температуре 4 °С, если предполагается проведение дополнительных экспериментов с использованием аналогичных условий выращивания.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мальтозо-дрожжевой экстракт солода (MYM)4 г мальтозы4 г дрожжевого экстракта10 г солодового экстрактадобавить 1 л H2O с использованием 50 % водопроводной воды и 50 % воды обратного осмоса и добавить 200 мл раствора микроэлемента R2 на 100 мл после автоклавирования			Спороносная среда, используемая для культивирования Streptomyces venezuelae SV60
R2 Раствор микроэлемента (TE)8 мг ZnCl240 мг FeCl 3-6H2O2 мг CuCl 2-2 O2мг MnCl2-4H 2O2 мг Na2B4O7-10H 2O2 мг (NH4)6Mo7O24-4H 2Oadd 200 мл H2OAutoclave и хранить при температуре 4 °C			Добавление 0.002 томов в MYM
PBS (фосфатно-солевой буфер)	Сигма	П4417-100ТАБ	Используется для заправки входных колодцев неиспользуемых полос в плитах В04А с целью подготовки плиты к кратковременному хранению.
Шприцевые фильтры 0,22 мкм	Satorius stedim	16532-К	Заготовка отработанного МИМ-ТЭ