Флуоресцентная покадровая визуализация жизненного цикла Streptomyces venezuelae

Аннотация

Источник: Шлимперт, С. и др. Флуоресцентная покадровая визуализация полного жизненного цикла S. venezuelae с использованием микрофлюидного устройства. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется флуоресцентная покадровая визуализация полного жизненного цикла бактерий Streptomyces venezuelae с использованием микрофлюидного устройства для визуализации прорастания, роста гиф и спороношения в режиме реального времени.

Протокол

1. Настройка микроскопа и протокола покадровой съемки

Заметка: Этот метод был реализован на полностью моторизованном и автоматизированном инвертированном широкопольном микроскопе, оснащенном камерой sCMOS, металлогалогенной лампой, аппаратным автофокусом, держателем предметного столика для 96-луночных планшетов и климатической камерой.

1. Предварительно прогрейте климатическую камеру до 30 °C, чтобы предотвратить проблемы с автофокусом после начала эксперимента. Требуемое время зависит от используемой климатической камеры, микроскопа и системы нагрева. Начинайте нагревать систему в ночь перед экспериментом.
2. Включите микроскоп и программное обеспечение для автоматизации и управления микроскопией. Для оптимального сбора сигналов и пространственного разрешения используйте масляный иммерсионный объектив с высокой числовой апертурой (NA), например масляный объектив DIC с 100X, 1,46 NA. Выберите подходящие фильтры и дихроматические зеркала для получения дифференциально-интерференционно-контрастных изображений (DIC) и изображений слияний желто-флуоресцентных и красных флуоресцентных белков.
3. Капните каплю иммерсионного масла на объектив и добавьте иммерсионную жидкость в нижнюю часть окна изображения на микрофлюидной пластине, чтобы улучшить фокусировку клеток во время получения изображения. Аккуратно установите герметичный микрофлюидный прибор на предметный столик инвертированного микроскопа. Убедитесь, что пластина надежно закреплена в держателе предметного стекла и не смещается в ходе эксперимента.
4. Сфокусируйте окно визуализации микрофлюидной камеры для культивирования с помощью встроенных маркеров положения для ориентации. Сосредоточьтесь на крайней левой части первой проточной камеры (обозначенной буквой «А») с размером сифона 5, что соответствует высоте сифона 0,7 мкм.
5. В программном обеспечении для микрогидродинамики тензодатчики из входного колодца 8 под давлением 4 фунта на квадратный дюйм в течение 15 секунд. Проверьте плотность клеток в камере для культивирования, переместив предметный столик через окно визуализации. Если споры не были захвачены, повторите этап загрузки клеток или в качестве альтернативы увеличьте давление загрузки и/или время до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность клеток (1-10 спор на окно визуализации размером 2048 x 2048 пикселей). Избегайте перегрузки камеры для культивирования. Заметка: Обычно мы используем ловушку размера 5 для визуализации Streptomyces, но мы также получили хорошие результаты с ловушками размером 4 и 3.
6. Запустите программу потока в управляющем программном обеспечении и дайте микрофлюидной пластине нагреться в течение 1 часа на предметном столике микроскопа перед началом получения изображения.
7. В программном обеспечении для управления микроскопом настройте многомерную съемку для получения нескольких изображений в нескольких положениях предметного стекла в течение определенного периода времени:
   1. Для автосохранения: укажите директорию для автоматического сохранения файлов изображений.
   2. Для настроек освещения заранее определите оптимальные настройки освещения для каждой конкретной конструкции. Для описанного эксперимента используйте следующие времена воздействия: DIC 150 мс, YFP 250 мс, RFP 100 мс.
   3. Для временных рядов: настройте временной ряд для получения изображений в нужных временных точках в определенной последовательности. Для визуализации жизненного цикла S. venezuelae выберите 40-минутный временной интервал в течение 24 часов.
   4. Для положений рабочей области и автофокусировки: сканируйте камеру для культивирования, перемещая рабочую область, и сохраняйте положения рабочей области для каждой интересующей точки изображения. Убедитесь, что одноступенчатые положения расположены достаточно далеко друг от друга, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание и фототоксичность. Как правило, используется до 12 позиций. Запустите процедуру автофокусировки для каждой временной точки, чтобы скорректировать медленный дрейф фокуса. Если это доступно в программном обеспечении для управления микроскопом, установите стратегию автофокусировки на «локальное обновление поверхности с помощью аппаратной автофокусировки». После того, как Z-координаты выбранных положений сцены будут проверены, активируйте аппаратный автофокус.
8. Запустите эксперимент с интервальной съемкой в управляющем программном обеспечении микроскопа.
9. Убедитесь, что все позиции сцены все еще находятся в фокусе на более поздних этапах. В экспериментах с интервальной съемкой, продолжающихся несколько часов, мы иногда наблюдаем смещение сцены даже при использовании автофокусировки. Если необходимо изменить фокусировку положения предметного столика, остановите эксперимент в нужный момент времени, отрегулируйте фокус и возобновите эксперимент в течение определенного интервала времени визуализации.
10. Прекратите получение изображений через 24-30 часов или после того, как гифы в исследуемой области дифференцируются в споры. Затем остановите проточную программу в программном обеспечении и разберите микрофлюидное устройство.
11. Подготовьте используемую микрофлюидную пластину к кратковременному хранению. Удалите остатки среды из лунок с 1 по 6, опорожните отработанную скважину 7 и ячейку загрузки 8. В стерильных условиях использованные лунки полосы «А» и скважины неиспользуемых полос («В» — «D») на пластине повторно заполняют стерильным фосфатно-солевым буфером (ПБС). Запечатайте пластину парапленкой, чтобы предотвратить ее высыхание, и храните при температуре 4 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
B04A Пластина CellAsic ONIX для бактериальных клеток	Мерк-Миллипор	Б04А-03-5ПК	Микрофлюидные планшеты для культивирования
Микрофлюидная перфузионная система CellAsic ONIX и ONIX FG (версия 5.0.2)	Мерк-Миллипор	ЭВ-262	Последнюю версию ONIX (июль 2015 г.) и инструкции по использованию программы можно найти здесь: http://www.merckmillipore.com
Микроскоп Axio Observer.Z1	Цейсс	431007-9902-000	Полностью автоматизированный и моторизованный инвертированный широкопольный микроскоп
Инкубатор XL multi S1 с температурным модулем S1 и нагревательным блоком XL S2	Цейсс	411857-9061-000	Климатическая камера вокруг микроскопа
Объектив План-Апохромат 100х/1.46 Масло DIC	Цейсс	420792-9800-000
Окра ФЛЭШ 4 V2	Хамамацу Фотоник К.К.	К11440-22КУ
Осветитель HXP 120В	Цейсс	423013-9010-000
Набор фильтров FL 46 HE YFP без переключения передач	Цейсс	489046-9901-000	Комплект флуоресцентных фильтров, возбуждение 500/25 нм, излучение 535/30 нм
Набор фильтров FL 63 HE RFP без сдвига	Цейсс	489063-0000-000	Комплект флуоресцентных фильтров, возбуждение 572/25 нм, излучение 629/30 нм
Монтажная рама K-M для многолуночных планшетов	Цейсс	000000-1272-644	Держатель столика для микрофлюидной пластины
ZEN pro 2012	Цейсс	410135-1002-120	Программное обеспечение для управления микроскопом
Таймлапс модуля ZEN	Цейсс	410136-1031-110	Программный модуль для настройки экспериментов с интервальной микроскопией
Плитки/позиции модуля ZEN	Цейсс	410136-1025-110	Программный модуль для сохранения определенных позиций сцены (xzy)
Фиджи	Программный комплекс с открытым исходным кодом	http://fiji.sc/Fiji	Создание цейтраферных фильмов
PBS (фосфатно-солевой буфер)	Сигма	П4417-100ТАБ	Используется для заправки входных колодцев неиспользуемых полос в плитах В04А с целью подготовки плиты к кратковременному хранению.
СВ60	Сбор штаммов Центра Джона Иннеса		Штамм S. venezuelae, экспрессирующий divIVA-mcherry и ftsZ-ypet