Роящееся поведение Pseudomonas aeruginosa в условиях антибиотического стресса

Аннотация

Источник: Бру, Д., и др., Покадровая визуализация бактериальных роев и коллективная реакция на стресс. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео показана процедура анализа роевого поведения Pseudomonas aeruginosa путем наблюдения за ростом бактерий от центральной культуры к сателлитным пятнам, содержащим ту же культуру, смешанную с антибиотиком, с использованием агаровой пластины и покадровой визуализации.

Протокол

1. Рост P. aeruginosa и условия гальванизации

1. Приготовьте 400 мл лизогенного бульона (LB), добавив 10 г порошковой смеси LB-Miller к 400 мл ddH₂O. Добавьте еще 8 г агара для 2% LB-агара для чашек Петри. Автоклав для стерилизации.
2. Налейте 20 мл расплавленной среды LB-агар в чашки Петри диаметром 10 см и дайте им застыть при комнатной температуре в течение ночи. Храните жидкие среды при комнатной температуре, а агаровые пластины при 4 °C.
3. Нанесите полосу P. aeruginosa на чашку Петри из замороженного бульона, хранящегося при -80 °C, с помощью стерильных петель или деревянных палочек. Инкубируйте чашку Петри вверх дном в течение ночи при температуре 37 °C. Храните чашку с LB-агаром при температуре 4 °C до 1 недели.
4. Выберите одну колонию из чашки Петри с помощью стерильной петли или деревянной палочки, внесите ее в среду объемом 2 мл и инкубируйте культуру до насыщения в течение ночи (16–18 ч) при 37 °C в роликовом барабане со скоростью 100 об/мин.
5. Пипетируйте 5 мкл ночного посева с шага 1.4 с помощью пипетки P20 и нанесите точку в центр роящейся агаровой пластины, подойдя к кончику пипетки под углом (10–45°) на 2,5 см над областью пятнистости, пипетируя вниз до первой остановки и касаясь агара только каплей жидкости (рис. 1B).
   1. Избегайте прикосновения к агару кончиком пипетки, так как это может повредить агар. Используйте шаблон, чтобы расположить пятно последовательно на разных роящихся агаровых пластинах.
6. Для лечения антибиотиками смешайте 30 мкл ночного посева P. aeruginosa с этапа 1.4 с 6 мкл 3 мг/мл гентамицина, 10 мкл 100 мг/мл канамицина или 7,5 мкл 100 мг/мл фосфомицина. Сразу переходите к следующему шагу.
   1. Пипетировать 6 мкл обработанной антибиотиками P. aeruginosa с помощью пипетки P20 и обнаружить в 6 равноудаленных спутниковых положениях на концентрической окружности радиусом 2,8 см вокруг центра чашки, приблизившись к кончику пипетки под углом (от 10 до 45°) на 2,5 см над областью пятен, пипетируя до первой точки, и прикосновение к агару только каплей жидкости (Рисунок 1D).
   2. Не прикасайтесь к агару кончиком пипетки, так как это может привести к его повреждению. Используйте шаблон гальванического покрытия для согласованности.
7. Замените прозрачные крышки чашек Петри на черные крышки (рисунок 2A).
8. Поместите роящиеся агаровые планшеты на сканер в инкубатор, установленный при температуре 37 °C, с водяной баней объемом 10 л для поддержания влажности 75% (рис. 1E, рис. 2B). ОСТОРОЖНОСТЬ: Не тревожьте пятнистые клетки на роящихся агаровых пластинах. Всегда держите тарелки лицевой стороной вверх.

Результаты

Рисунок 1: Схема анализа роения P. aeruginosa и коллективной реакции на стресс. (А) клетки P. aeruginosa выращивают в течение ночи (от 16–18 ч до₆₀₀ OD приблизитель...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагентов
Бактоагар, обезвоженный	BD Difco	214010	Для пластины LB-агара и роящейся агаровой пластины
Казаминокислоты	BD Difco	223050	Для роящихся сред
D-глюкоза	Фишер Кемикал	Д16500	Глюкоза. Для роящихся сред
Фосфомицин динатриевая соль	Токийская химическая промышленность	Ф0889	Стоковая концентрация: 200 мг/мл. Растворен в ddH₂O
Сульфат гентамицина	Сигма-Олдрич	Г1914	Исходная концентрация: 3 мг/мл. Растворен в ddH₂O
Канамицина сульфат	Сигма-Олдрич	60615	Стоковая концентрация: 100 мг/мл. Растворен в ddH₂O
ЛБ-Миллер	BD Difco	244620	Для бульона LB и пластин с LB-агаром
Гептагидрат сульфата магния	Сигма-Олдрич	230391	Для роящихся сред
Штаммов
Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa)	Лаборатория Сирьяпорн	АФС27Э.118	Штамм PA14
Припасы
Наждачная бумага из оксида алюминия	3 МИН.	150 Штрафной	Для черных век
Черная ткань	Джоан	PRD7089	Черная ткань
Черная аэрозольная краска	Крылон	5592 Матовый черный	Для черных век
Фляга Эрленмейера	Кимакс	26500	250 мл
Стеклянные бутылки для хранения	Пирекс	13951Л	250 мл, 500 мл, 1000 мл
8-дюймовые стяжки на молнии	Гарднер Бендер	E173770	Для крепления черной матовой ткани
Чашки Петри (100 мм x 15 мм)	Рыбак	FB0875712	Пенополистирольные пластины 100 x 15 мм
Деревянные палочки	Рыбак	23-400-102	Для нанесения полос и инокуляции бактерий
Оборудование
Автоклав	Маркет Кузница Индастриев	СТМ-Е	Для стерилизации реагентов
Пипетка 25 мл	США Сайентикал, Инк.	1072-5410	К пипетке 20 мл для роящихся агаровых пластин
Влагопоглотитель	Frigidaire	FAD704DWD 70 пинт	Для поддержания относительной влажности воздуха в помещении на уровне около 45%
Инкубатор	ВВР	89032-092	Для роста бактерий при 37 °C
Водяная баня Isotemp	Рыбак	15-462-21Q	Для охлаждающих сред до 55 °C
Ламинарный колпак	Компания Бейкер	СГ603А	Для сушильных пластин
Пипетка-20	Гилсон	F123601	Пятнистость на роящихся агаровых пластинах
Контроллер пипетки	БрендТех	Акку-Джет	К пипетке 20 мл для роящихся агаровых пластин