Индукция дифференцировки парагемолитического вибриона в клетки Swarmer

Аннотация

Источник: Heering, J., et al. Индукция клеточной дифференцировки и визуализация отдельных клеток Vibrio parahaemolyticus Swimmer и Swarmer. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео показана индукция дифференцировки клеток Swarmer в Vibrio parahaemolyticus с использованием специально приготовленной агаровой среды. Манипулируя сигналами окружающей среды, такими как истощение железа, добавки кальция и поверхностный контакт, бактерии стимулируются к переходу от своей пловцовой формы к удлиненным клеткам роя с боковыми жгутиками. Эти дифференцированные клетки распространяются по поверхности твердого тела, образуя характерные роевые вспышки, которые означают успешные морфологические изменения.

Протокол

1. Индукция дифференцировки клеток Swarmer

ЗАМЕТКА: Следующие шаги описывают, как индуцировать дифференцировку V. parahaemolyticus в его жизненный цикл и как стимулировать пролиферацию на твердых поверхностях.

1. Суспензируйте 4 г сердечного настоя (HI) агара в 100 мл ddH₂O для приготовления роящихся пластин.

2. Тщательно вскипятите раствор агара HI в микроволновой печи и время от времени встряхивайте бутылку, пока порошок не растворится. Автоклав при 121 °C в течение 20 мин.

3. После автоклавирования охладите HI агар до 60-65 °C. Добавьте 2,2'-бипиридил до конечной концентрации 50 μМ (стоковый раствор 50 мМ в 100% этаноле). Добавьте CaCl₂ до конечной концентрации 4 мМ (исходный раствор 4 М в ddH₂O). При необходимости добавьте в раствор антибиотики для поддержания плазмид.

ЗАМЕТКА: Если вы планируете использовать индуцируемую плазмиду, добавьте индуцирующий агент до ее конечной концентрации.

ВНИМАНИЕ: 2,2'-бипиридил: Острая токсичность (перорально, кожно, ингаляционно). Используйте перчатки и защитные очки при работе с этим химическим веществом.

4. Налейте 30 - 35 мл конечного раствора агара HI в круглую чашку Петри диаметром 150 мм и дайте агару застыть.

5. Непосредственно перед обнаружением клеточной культуры просушите агаровую пластину при температуре 37 °C в течение не менее 10 минут (или до тех пор, пока остатки жидкости не исчезнут, но не исчезнут) вертикально под открытой крышкой.
ЗАМЕТКА: Время сушки в значительной степени зависит от используемого инкубатора, и сильно высушенные планшеты не допускают роения V. parahaemolyticus. (Этот шаг очень важен!) Тарелки должны быть свежими и не старше 2 - 3 часов. Старые тарелки будут слишком сухими, чтобы стимулировать роение.

6. Введите небольшое количество клеток с края одной колонии в 5 мл бульона Лурии-Бертани (LB). Инкубируют культуру, встряхивая при 37 °C, до достижения OD₆₀₀ = 0,8, обычно это занимает около 2-3 часов. После этого клетки готовы к обнаружению на роящихся агаровых пластинах HI.

7. Найдите 1 мкл клеточной культуры в центре роящейся пластины из агара HI (рис. 1A).

8. Дайте пятну высохнуть (Рисунок 1B).

9. Заклейте пластину прозрачной пластиковой лентой и убедитесь, что она надежно закреплена, в противном случае она может отсоединиться во время ночной инкубации (рисунок 1C).

ЗАМЕТКА: Очень важно, чтобы уплотнение было идеальным. Избегайте образования пузырьков воздуха и складок на ленте при ее нанесении.

10. Инкубируйте пластину при температуре 24 °C в течение ночи. Это приведет к образованию роевой колонии V. parahaemolyticus с роевыми вспышками, распространяющимися с периферии роевой колонии (рис. 2).

Результаты

Рисунок 1: Индукция дифференцировки Swarmer и подготовка клеток к микроскопической визуализации. Упрощена визуализация рабочего процесса по получению клеток V. parahaemolyticus swarmer и подготовка предметных стекол м...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Компоненты мультимедиа
LB средний	Рот	Х968.3
Агар Difco, гранулированный	БД	214510	Для приготовления LB агара со средой LB
Difco Сердечный инфузионный агар	БД	244400	Для приготовления роящихся пластин HI агара
Агароза NEEO, ультра качество	Рот	2267.3	Для приготовления для микроскопии агарозные подушечки
Добавок
2,2'-бипиридил	Сигма Олдрич	D216305-25G	Для приготовления роящихся пластин HI агара
Дигидрат хлорида кальция	Рот	5239.1	Для приготовления роящихся пластин HI агара
Скобяные изделия
Чашка Петри 150 мм x 20 мм с кулачками	Сарштедт	82.1184.500	Для приготовления роящихся пластин HI агара
кельвитрон т (В 6420)	Герей	-	Используется для сушки пластин роения агара HI