Мониторинг бактериальной инфекции и доставки эффекторных белков в растительные клетки

Аннотация

Источник: Lee, H. et al., Split Green Fluorescent Protein System для визуализации эффекторов, доставляемых бактериями во время инфекции. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео показан метод мониторинга бактериальной инфекции и доставки эффекторных белков в растительные клетки с использованием комплементации зеленого флуоресцентного белка (sfGFP) в сочетании с конфокальной микроскопией. Этот подход позволяет точно визуализировать транслокацию эффектора в цитозоль клетки-хозяина.

Протокол

ЗАМЕТКА: Все действия выполняются при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Подготовка растительного сырья (4 недели)

1. Подготовка растений Nicotiana benthamiana
   1. Посейте по 2 семена N. benthamiana на поверхность почвы каждого горшка, накройте лоток пластиковым куполом и дайте семенам прорасти в камере роста при температуре 25 °C, влажности 60% с 16/8-часовым фотопериодом свет/темнота.
   2. Через две недели выберите и выбросьте самый маленький саженец в каждый горшок. Продолжайте выращивать растения в тех же условиях роста, которые применялись для проращивания на шаге 1.1.1. Добавляйте 1 л воды в поддон каждые два дня.
      ЗАМЕТКА: Условия роста растений могут различаться в разных лабораториях. Поэтому соблюдайте регулярный протокол полива, чтобы вырастить растение в здоровом состоянии.
   3. Через неделю переложите растения в новый лоток и обустройте их достаточным пространством для дальнейшего роста. Продолжайте выращивать растения в условиях, описанных в шаге 1.1.1, пока они не будут готовы к проникновению в возрасте 4 недель.
      ЗАМЕТКА: Рост растений может отличаться в зависимости от условий роста в разных лабораториях. Обычно мы обнаруживаем, что 4-недельные растения N. benthamiana имеют около шести листьев.
2. Препарат для трансгенных растений Arabidopsis thaliana
   1. Обратитесь к Таблице материалов и закажите трансгенные семена арабидопсиса .
   2. Замочите ~50 - 100 трансгенных семян арабидопсиса в 1 мл дистиллированной воды и храните их при температуре 4 °C в течение 3 дней в темноте, чтобы синхронизировать начало прорастания.
   3. Посейте ~2 - 3 семечка на поверхность почвы пробкового лотка для растений и накройте лоток пластиковым куполом. Дайте семенам прорасти при температуре 23 °C, влажности 60% с 10/14-часовым фотопериодом свет/темнота.
      ЗАМЕТКА: Семена должны быть гомозиготными. Тем не менее, мы рекомендуем повторно подтвердить наличие трансгена в партии. В этом случае стерилизуйте семена путем промывки 70% этанолом в течение 2 мин, 50% хлорной извести (около 2% гипохлорита) содержащим 0,05% Тритон Х-100 в течение 5 мин. Затем следует промывание 5 - 6 раз стерильной двойной дистиллированной водой (ддН₂О). После стерилизации стратифицировать при 4 °C в течение 3 дней и поместить их на среду для прорастания растений, содержащую 25 мкг/л гигромицина В, для отбора трансгенных растений.
   4. Через неделю оставьте только одно растение на пробку и продолжайте выращивать растения в тех же условиях роста, которые использовались для шага 1.2.3.
      ЗАМЕТКА: Четырехнедельные растения были использованы для лечения инфекции Pseudomonas syringae . Поливайте растения через день, чтобы сохранить их здоровыми.

2. Подготовка культуры Pseudomonas (~1 неделя)

1. Построение плазмиды для трансформации Pseudomonas
   1. Обратитесь к таблице материалов и закажите желаемый вектор (векторы) эффекторной системы доставки на основе эффекторной системы доставки типа III (T3SS).
   2. Вставьте интересующий вас ген эффектора в вектор доставки эффектора с помощью сайт-специфичного рекомбинационного клонирования.
      ЗАМЕТКА: При мониторинге субклеточной локализации полноразмерного эффекторного белка поместите полноразмерный ген в pBK-GW-1-2 или pBG-GW-1-2. Также можно выбрать pBK-GW-1-4 или pBG-GW-1-4, содержащие 2x sfGFP11 (11-я β-цепь sfGFP) для увеличения флуоресцентного сигнала. В случае отсутствия у частичного эффектора сигнального пептида используют pBK-GW-2-2 или pBK-GW-2-4.
2. Трансформируйте плазмиду, несущую эффектор, слитый с меткой sfGFP11, в P. syringae pv. Томат (Pst) CUCPB5500 с помощью стандартной электропорации.
   ЗАМЕТКА: При необходимости можно использовать и другие штаммы Pseudomonas . Система меток sfGFP11 сконструирована для широкого спектра векторов, а экспрессия генов эффектора регулируется промотором AvrRpm1, который сравним, например, с Pseudomonas fluorescens (EthAn).
3. Аккуратно распределите трансформированные бактериальные клетки по поверхности агаровых пластин King's B, содержащих 100 мкг/мл рифампицина и 25 мкг/мл канамицина или 25 мкг/мл гентамицина. Выдерживать при температуре 28 °C в течение 2 суток.
4. Инокулируйте одну колонию в жидкую среду King's B антибиотиками, подходящими для используемого вектора, и выращивайте клетки в течение ночи при температуре 28 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
5. Сделайте глицериновый бульон. Добавьте автоклавный глицерин до конечной концентрации 50% и храните при температуре -80 °C.

3. Транзиторная экспрессия Organelle-targeted sfGFP1-10^OPT (1-10-я^β-цепь sfGFP) у N. benthamiana (4 дня)

1. Приготовление агробактериальной культуры
   1. Закажите желаемый вектор (векторы) плазмид sfGFP1-10^OPT , нацеленных на органеллы (см. Таблицу материалов).
   2. Трансформируйте плазмиду (плазмиды) в клетки штамма Agrobacterium tumefaciens GV3101. Выращивайте клетки на агаровой среде Лурии-Бертани (LB) с добавлением 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл рифампицина при 28 °C в течение 2 дней.
   3. Из одной колонии в среде LB-агара инокулируйте клетки в 5 мл жидкой среды LB с добавлением 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл рифампицина. Выращивайте клетки в течение ночи при температуре 28 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
   4. Соберите клетки центрифугированием при давлении 3 000 x g в течение 10 минут. Слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл свежеприготовленного инфильтрационного буфера.
   5. Измерьте количество агробактерий, получив значение оптической плотности (OD) при поглощении 600 нм (Abs 600 нм). Отрегулируйте внешний диаметр₆₀₀ бактерий до 0,5 с помощью инфильтрационного буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мл суспензии достаточно для инфильтрации в двух местах.
   6. Оставьте культуру при комнатной температуре на щадящем качалке на 1 - 5 ч до инфильтрации.
   7. Проделайте отверстие в центре листьев, в которые нужно проникнуть, с помощью наконечника объемом 10 мкл. Используйте безыгольный шприц объемом 1 мл для инфильтрации суспензий агробактерий . Осторожно и медленно ввести около 500 мкл суспензий, приготовленных на шаге 3.1.5, в адаксиальную сторону листа через шприц. Повторите инфильтрацию по крайней мере на трех разных растениях для экспериментального повторения.
      ЗАМЕТКА: По соображениям здоровья и безопасности во время инфильтрации следует носить защитные очки.
   8. Сотрите остатки бактериальной суспензии на листьях и обозначьте границу инфильтрированного участка.
   9. Выдерживайте инфильтрированные растения в тех же условиях роста, которые использовались для шага 1.1.1, в течение 2 дней.

4. Посев Pseudomonas (4 дня)

1. Перебейте трансформированный штамм Pseudomonas из запасов глицерина на этапе 2.5 на среду King's Bagar соответствующими антибиотиками при 28 °C в течение 2 дней.
   ЗАМЕТКА: Здоровье Pseudomonas очень критично. Если колонии не формируются хорошо, снова проведите полосы между клетками или размножьте клетки в жидкой среде King, прежде чем продолжить.
2. Инокулируйте полный цикл клеток Pseudomonas в жидкую среду маннит-глутамата (MG) при температуре 28 °C с встряхиванием при 200 об/мин в течение ночи.
3. Соберите клетки центрифугированием при давлении 3 000 x g в течение 10 минут. Слейте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 10 мМ MgCl2 и отрегулируйте наружный диаметр₆₀₀ до 0,02 (1 x 10⁷ кое/мл) для листьев N. benthamiana и до 0,002 (1 x 10⁶ кое/мл) для листьев Arabidopsis.
4. Для N. benthamiana инфильтрируйте суспензию Pseudomonas в область листьев, где за 2 дня до этого была инфильтрирована агробактерия, несущая конструкцию sfGFP1-10^OPT (как на шаге 3.1.7). Для трансгенного Arabidopsis sfGFP1-10^OPT инфильтрируйте суспензию Pseudomonas в два 4-недельных коротких листьев, выращенных днем.
   ЗАМЕТКА: Для экспериментальных тиражей необходимо не менее трех заводов.

5. Наблюдение за сигналом sfGFP с помощью конфокальной микроскопии (1 день)

1. Вырежьте листовой диск из привитых Pseudomonas листьев. В определенные моменты времени после инфильтрации Pseudomonas сфотографируйте два 2-сантиметровых диска из двух листьев одного растения с помощью лазерной сканирующей конфокальной системы с 40X/1,2 числовой апертурой (NA) C-Apochromat или масляным иммерсионным объективом C-Apochromat 63X/0,8 NA. Чтобы избежать гибели мертвых клеток в результате ранения, наблюдайте за камерами вдали от инфильтрационного отверстия.
2. Начните наблюдение с низкой мощности аргонового лазера с длиной волны 488 нм. Увеличьте мощность лазера для обнаружения sfGFP.
   ЗАМЕТКА: Обычно мы используем 2 - 15% от интенсивности лазера для обнаружения сигнала флуоресценции. Тем не менее, мощность лазера и настройки обнаружения должны регулироваться в зависимости от системы микроскопии пользователя. Здесь эмиссионные фильтры были установлены на 520 - 550 нм. Мертвые клетки часто излучают аутофлуоресценцию под действием лазерного возбуждения с длиной волны 488 нм. Следовательно, в качестве отрицательного контроля тот же эффектор без метки sfGFP11 должен быть инфильтрирован и наблюдаться в тех же условиях наблюдения. Кроме того, высокое лазерное возбуждение может индуцировать автофлуоресценцию хлорофилла. Поэтому регулируйте интенсивность лазера с помощью контрольных растительных клеток так, чтобы не индуцировать автофлуоресценцию хлорофилла.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Трансгенные линии Arabidopsis			Парк, Э., Ли, Х. Й., Ву, Д., Чой, Д. и Динеш-Кумар, С.. Пространственно-временной мониторинг эффекторов Pseudomonas syringae с помощью секреции типа III с использованием расщепленных флуоресцентных фрагментов белка. Растительная клетка. 29 (7), 1571-1584 (2017)
ЦИТО-СФГФП1-10	АБРК	CS69831
НУ-сфГФП1-10	АБРК	CS69832
ПТ-сфГФП1-10	АБРК	CS69833
МТ-sfGFP1-10	АБРК	CS69834
ПХ-сфГФП1-10	АБРК	CS69835
ЭР-сфГФП1-10	АБРК	CS69836
ГО-СФГФП1-10	АБРК	CS69837
ПМ-сфГФП1-10	АБРК	CS69838
Плазмида sfGFP1-10OPT, нацеленная на органеллы			Парк, Э., Ли, Х. Й., Ву, Д., Чой, Д. и Динеш-Кумар, С.. Пространственно-временной мониторинг эффекторов Pseudomonas syringae с помощью секреции типа III с использованием расщепленных флуоресцентных фрагментов белка. Растительная клетка. 29 (7), 1571-1584 (2017)
ЦИТО-СФГФП1-10	Адджен	97387
НУ-сфГФП1-10	Адджен	97388
ПТ-сфГФП1-10	Адджен	97389
МТ-sfGFP1-10	Адджен	97390
ПХ-сфГФП1-10	Адджен	97391
ЭР-сфГФП1-10	Адджен	97392
ГО-СФГФП1-10	Адджен	97393
ПМ-сфГФП1-10	Адджен	97394
ER-sfCherry1-10	Адджен	97403
ЭР-сфYФП1-10	Адджен	97404
ЦИТО-СФКФ1-10	Адджен	97405
sfGFP11-taged Совместимый вектор для системы доставки эффекторов на основе T3SS	Парк, Э., Ли, Х. Й., Ву, Д., Чой, Д. и Динеш-Кумар, С.. Пространственно-временной мониторинг эффекторов Pseudomonas syringae с помощью секреции типа III с использованием расщепленных флуоресцентных фрагментов белка. Растительная клетка. 29 (7), 1571-1584 (2017)
пБК-ГВт-1-2	Адджен	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к канамицину (25 мкг/мл)
пБК-ГВ-1-4	Адджен	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к канамицину (25 мкг/мл)
пБК-ГВ-2-2	Адджен	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к канамицину (25 мкг/мл)
пБК-ГВ-2-4	Адджен	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к канамицину (25 мкг/мл)
пБГ-ГВ-1-2	Адджен	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к гентамицину (25 мкг/мл)
pBG-GW-1-4	Адджен	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к гентамицину (25 мкг/мл)
pBG-GW-2-2	Адджен	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к гентамицину (25 мкг/мл)
пБГ-ГВ-2-4	Адджен	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Устойчив к гентамицину (25 мкг/мл)
Штаммы бактерий
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Чаба Конч и Джефф Шелл, Промотор гена TL-ДНК 5 контролирует тканеспецифичную экспрессию химерных генов, переносимых новым типом бинарного вектора Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Устойчив к гентамицину (50 мкг/мл) и рифампицину (50 мкг/мл)
Pseudomonas syringae pv. Томатный CUCPB5500			Квитко, Б. Х. и др. Делеции в репертуаре Pseudomonas syringae pv. Гены эффекторов секреции DC3000 типа III типа выявляют функциональное перекрытие между эффекторами. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Устойчив к рифампицину (100 мкг/мл)
Компоненты мультимедиа
Среды для проращивания растений			Добавьте в воду 2,165 г/л порошка Мурашиге и Скуга, 10 г/л сахарозы. Отрегулируйте pH до 5,8 и добавьте 2,2 г/л фитагеля. Автотель.
Среда Мурасиге и Скуг в составе витаминов	Дючефа Биохеми	М0222	Хранить при температуре 4 °C.
Сахароза	Дючефа Биохеми	С0809
Фитагель	Сигма-Олдрич	П8169
LB медиа			Добавьте в воду 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl. Для твердых сред добавьте 15 г/л микроагара. Автоклав. Дайте раствору остыть до 55 °C и при необходимости добавьте антибиотик.
Триптон	BD Bioscience	211705
Дрожжевой экстракт	BD Bioscience	212750
NaCl	Дючефа Биохеми	С0520
Микроагар	Дючефа Биохеми	М1002
Кингс Б медиа			10 г/л пептона протеазы #2, 1,5 г/л безводного К2HPO4, 15 г/л агара в воду. Автоклав. Охладите до 55 °C и добавьте в среду стерильный 15 мл/л глицерина, 5 мл/л MgSO4 . При необходимости добавьте антибиотики.
Протеозный пептон	BD Bioscience	212120
Безводный К2ГПО4	Сигма-Олдрич	1551128 УТП
Глицерин	Дючефа Биохеми	Г1345
MgSO4	Сигма-Олдрич	М7506
Бакто-агар	BD Bioscience	214010
Жидкие среды маннит-глутамат (MG)			Добавьте в воду 10 г/л маннитола, 2 г/л L-глутаминовой кислоты, 0,5 г/л KH2PO4, 0,2 г/л NaCl и 0,2 г/л MgSO4 . Настройка на pH 7
Маннитол	Дючефа Биохеми	М0803
L-глутаминовая кислота	Дючефа Биохеми	Г0707
КХ2ГО4	Сигма-Олдрич	NIST200B
Инфильтрационный буфер			10 мМ MES (2-(N-морфолино)-этана сульфоновая кислота), 10 мМ MgCl2, 150 мкМ ацетосирингона. рН 5,6; Перед использованием подготовьте свежий буфер.
МЧС	Дючефа Биохеми	М1503	Приготовьте 100 мМ (pH 5,6) бульон в воде. Фильтр простерилизовать.
MgCl2	Сигма-Олдрич	М8266	Приготовьте 100 мМ бульона в воде. Автоклав.
Ацетосирингон	Сигма-Олдрич	D134406	Приготовьте 150 мМ запас в ДМСО.
Оборудование/материалы для конфокального микроскопа
Лазерная сканирующая конфокальная система 710	Карл Цейсс
Инвертированный микроскоп Axio observer Z1	Карл Цейсс