Целенаправленная изоляция бактериальных колоний с использованием деградации гидрогеля с легким рисунком

Abstract

Источник: Fattahi, N., et al. Фоторазлагаемые гидрогелевые интерфейсы для скрининга, отбора и изоляции бактерий. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео демонстрируется экстракция бактериальных колоний из фоторазлагаемого гидрогеля с помощью ультрафиолетового излучения. Выбирается конкретная колония, и разрабатывается структурированное воздействие света, чтобы инициировать локализованное разложение гидрогеля. После регулировки интенсивности и продолжительности света подается ультрафиолетовый свет, освобождая колонию. Затем колония отсасывается через трубки и переносится в пробирку для последующего анализа.

Protocol

1. Бактериальные штаммы и протоколы культивирования

1. Разрежьте колонии бактерий на агаровых пластинах, дополненных соответствующими питательными средами. В данном отчете B. subtilis (штамм 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) культивируется на ATGN (0,079 M KH₂PO₄ (дигидрофосфат калия), 0,015 M (NH₄)₂SO₄ (сульфат аммония), 0,6 мМ MgSO₄·7H₂O (гептагидрат сульфата магния), 0,06 мМ CaCl₂·2H₂O (дигидрат хлорида кальция), 0,0071 мМ MnSO₄·H₂O (моногидрат сульфата марганца(II)), 0,125 М FeSO₄·7H₂O (гептагидрат сульфата железа), 28 мМ глюкозы, pH: 7 ± 0,2, 15 г/л агара) агаровые пластины с добавлением 100 мкг/мл спектиномицина и E. coli (штамм 25922, ATCC) на агаровых пластинах ATGN с добавлением ампициллина 100 мкг/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущих сообщениях об инкапсуляции гидрогеля и высвобождении с помощью этих материалов использовались клетки A. tumefaciens C58
2. Выберите нужные колонии из агаровых пластин ATGN и приступайте к выращиванию культур на ночь. Используемые здесь штаммы E. coli и B. subtilis культивируют при температуре 37 °C и встряхивают при 215 об/мин в жидкой среде ATGN в течение 24 ч. Храните клеточные культуры в 50% глицерине при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
3. Отоберите колонии обоих штаммов из запасов глицерина с помощью стерильных контуров инокуляции и инкубируйте в жидких средах ATGN в течение 24 ч при 37 °C и 215 об/мин.

2. Подготовка материала, необходимого для образования гидрогеля

1. Синтез фоторазлагаемого ПЭГ-о-NB-диакрилата (полиэтиленгликоль)-ортобензил-диакрилата)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренний синтез PEG-o-NB-диакрилата был хорошо описан и ранее о нем сообщалось. В качестве альтернативы, поскольку синтез является рутинным, он может быть передан на аутсорсинг из предприятия химического синтеза.
2. Буфер сшивки
   1. Возьмите рецепт выбранной среды для штамма бактерий и приготовьте среду с 2x питательными веществами. Добавьте фосфат, например,₂PO₄ (дигидрофосфат натрия), в среду до конечной концентрации 100 мМ. Затем отрегулируйте значение pH до 8 с помощью 5 М NaOH (гидроксид натрия) (водный).
   2. Стерилизуйте буферный раствор и храните его при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите все переходные металлы, присутствующие в среде, так как эти металлы катализируют окисление тиолов до дисульфидов.
3. Раствор PEG-o-NB-диаакрилата
   1. На каждый мг аликвотного порошка PEG-o-NB-диакрилата (молекулярная масса 3400 Да) добавьте 3,08 мкл ультрачистой воды, чтобы достичь концентрации 49 мМ PEG-o-NB-диакрилата (98 мМ концентрации акрилата).
   2. Перемешайте раствор до тех пор, пока он хорошо не перемешается, и храните этот раствор при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
4. 4-плечевой раствор ПЭГ-тиола
   1. Для получения ПЭГ-тиола (молекулярная масса 10 000 Да) с 4 группами добавьте 4 мкл сверхчистой воды на мг порошка для достижения концентрации 20 мМ (80 мМ концентрации тиола).
   2. Ввергните этот раствор в вихрь до тех пор, пока он хорошо не перемешается, и храните этот раствор при температуре -20 °C до дальнейшего использования.

3. Приготовление перфторалкилированных (нереакционноспособных) покровных стекол

1. Поместите до 5 стеклянных слайдов (25 мм x 75 мм x 1 мм) внутрь полипропиленовой скользящей почтовой машины. Обработайте предметные стекла ультразвуком 2% (по массе) раствором моющего средства (Таблица материалов) в течение 20 минут.
2. Трижды промойте слайды ультрачистой водой, затем обработайте их ультразвуком в воде в течение 20 минут. Высушите слайды с помощью струи N₂ (азота).
3. Плазменная очистка (см. Таблицу материалов) с обеих сторон стекол в соответствии с протоколом в разделе 4.1 в течение 2 мин.
4. Поместите очищенные плазмой предметные стекла обратно в почтовую машину и заполните контейнер 0,5% (v/v) раствором трихлора(1H, 1H, 2H, 2H,-перфтороктил)силана в толуоле. Дайте этим стеклянным предметным стеклам функционализироваться в течение 3 часов при комнатной температуре (RT).
5. После того, как слайды будут функционализированы, промойте слайды внутри почтовой машины, сначала толуолом, а затем этанолом (по три раза с каждым растворителем). Затем высушите каждую функционализированную горку струей N₂.

4. Приготовление тиол-функционализированных (базовых) покровных покрытий

1. Очистка стеклянных покровных стекол с помощью плазменного очистителя
   1. Поместите покровные стекла размером 18 мм x 18 мм в чашку Петри. Затем поместите чашку Петри в камеру плазмоочистителя и включите мощность плазменного очистителя.
   2. Включите вакуумный насос, чтобы очистить воздух из камеры, пока манометр не покажет 400 мторр.
   3. Откройте дозирующий клапан, чтобы впустить воздух в камеру до тех пор, пока манометр не достигнет постоянного давления (800-1000 мТорр). Затем выберите RF в режиме «Hi» и выставьте покровные стекла на 3 минуты.
   4. Через 3 минуты выключите радиочастотный режим и вакуумный насос.
   5. Выньте чашку Петри из камеры, переверните покровные крышки, поместите их обратно в камеру для плазмы и обнажите другую сторону стеклянной крышки.
   6. Повторите шаги 4.1.2-4.1.4 для очистки необработанной стороны покровного стекла плазмой.
   7. После завершения процесса извлеките чашку Петри из камеры и выключите плазмоочиститель и вакуумный насос.
2. Очистка и гидроксилирование покровных стекол раствором пираньи
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные протоколы очистки пираний могут быть использованы для очистки и гидроксилирования стеклянных шликеров. Раствор пираньи представляет собой смесь H₂O₂ (перекись водорода) и H₂SO₄ (серная кислота) в соотношении 30:70 (v/v). Также можно использовать альтернативные методы очистки стеклянных покровных стекол.
   ВНИМАНИЕ: Раствор пираньи сильно коррозионный и взрывоопасный по отношению к органическим растворителям, и с ним следует обращаться с особой осторожностью. Должны быть приняты соответствующие меры безопасности и сдерживания, такие как использование надлежащих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, химически стойкий фартук, защитные очки, лицевой щиток, кислотостойкие бутиловые перчатки). Перед использованием вся стеклянная посуда и рабочие поверхности, контактирующие с раствором пираньи, должны быть чистыми, сухими и очищенными от органических остатков. Раствор пираньи ни в коем случае нельзя хранить в частично закрытой или закрытой таре.
   1. Поставьте чистую стеклянную тарелку размером 100 мм x 50 мм на магнитную мешалку с конфоркой с регулируемой скоростью перемешивания под вытяжной шкаф и добавьте в чашку 14 мл H₂SO₄ .
   2. Аккуратно поместите небольшую магнитную полоску с тефлоновым покрытием с помощью щипцов с тефлоновым покрытием внутрь формы. Затем медленно поворачивайте мешалку, чтобы не разбрызгать кислоту.
   3. Затем аккуратно добавьте в форму 6 мл H₂O₂ и дайте раствору хорошо перемешаться.
   4. Выключите мешалку, затем снимите мешалку с посуды с помощью щипцов. Далее аккуратно поместите покровные листы внутрь посуды с помощью щипцов и установите температуру 60–80 °C.
   5. Через 30 минут аккуратно снимите покровные листы с помощью щипцов и дважды погрузите их в деионизированную воду (DI), чтобы смыть остатки раствора пираньи.
   6. После промывки водой храните покровные стекла в деионизированной воде при температуре RT до дальнейшего использования.
   7. Выключите конфорку и дайте раствору пираньи остыть.
   8. Чтобы утилизировать раствор пираньи, аккуратно поместите стеклянную тарелку размером 100 мм x 50 мм, содержащую охлажденный раствор пираньи, в большую пустую стеклянную чашку объемом не менее 1,5 л. Затем добавьте 1 л воды для разведения и добавьте порошок гидрокарбоната натрия для нейтрализации. Обратите внимание, что бикарбонат натрия вызывает образование пузырей и выделение тепла, и его следует добавлять очень медленно; В противном случае барботирование может привести к разбрызгиванию кислоты. Если дальнейшее добавление бикарбоната натрия не вызывает образования пузырей, проверьте pH с помощью бумаги pH, чтобы убедиться, что он был нейтрализован. Как только раствор будет нейтрализован и остынет, его можно выливать в раковину.
3. Тиоловая функционализация покровных изделий
   1. Приготовьте 5% (v/v) раствор 269 мМ (3-меркаптопропил) раствора триметоксисилана (MPTS) в сухом толуоле.
   2. Добавьте 10 мл раствора в отдельные конические центрифужные пробирки объемом 50 мл. Поместите по одному очищенному покровному стекло в каждую пробирку и погрузите его в раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Один покровный стекло на пробирку объемом 50 мл используется для обеспечения тиолирования обеих сторон подложки без помех со стороны других подложек.
   3. Через 4 часа промойте каждый покровный лист (четыре стирки на один покровный лист) толуолом, этанолом 1:1 (v/v) смесью толуола и этанолом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается путем последовательного погружения каждого покровного стекла в конические центрифужные пробирки, содержащие упомянутые растворы.
   4. После промывки основания погрузите его в этанол и храните при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества покровных слипов, этот метод может стать трудоемким из-за обработки покровных слипов по одному. Для нескольких покровных стекол можно использовать банки Columbia, которые подходят к нескольким покровным стеклам одновременно.

5. Изготовление кремниевых микролуночных массивов

1. Покрытие из парилена: используйте стандартный протокол, описанный в предыдущих научных статьях, для покрытия кремниевых пластин париленом.
2. Микропроизводство: Следуйте протоколу, описанному Баруа и др., для проектирования и изготовления массива микролунок. ​

6. Образование гидрогеля

1. Объемное образование гидрогеля на стеклянных покровных стеклах
   1. Раствор прекурсора гидрогеля: добавьте 12,5 мкл буфера для сшивания в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, а затем 5,6 мкл раствора PEG-o-NB-диакрилата. Наконец, добавьте в смесь 6,9 мкл 4-плечевого раствора ПЭГ-тиола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление в смесь тиола PEG с 4 плечами запускает реакцию сшивания. Таким образом, раствор гидрогелевого прекурсора следует использовать сразу после смешивания.
   2. Для инкапсуляции клеток в растворе гидрогелевого предшественника выполните шаги 6.1.3-6.1.9.
   3. Для инкапсуляции ячеек перед шагом 6.1.1 инокулируйте буфер для сшивки с желаемой плотностью клеток. Как сообщалось ранее19, было замечено, что плотность клеток 7,26 ×^{10 7} КОЕ/мл в буфере для сшивки коррелирует с плотностью ~ 90 клеток/^мм2 , инкапсулированных через гидрогель.
   4. Поместите тиолированную основу на чистую чашку Петри. Поместите две распорки (см. Таблицу материалов) на две противоположные стороны покровного стекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тиоловая функционализация покровных стекол необходима для ковалентного прикрепления гидрогеля к поверхности покровного стекла. Это происходит за счет реакции тиоловых групп на поверхности и акрилатных групп, присутствующих в растворе гидрогелевого предшественника.
   5. Закрепите распорки на нижнем покровном листе, прикрепив распорки к чашке Петри.
   6. Пипеткой наберите желаемый объем раствора прекурсора на нереактивном перфторалкилированном предметном стекле.
   7. Поместите предметное стекло с перфторалкилированным стеклом на нижнее покровное стекло (рис. 1C). Подождите 25 минут при ртутной терапии, чтобы образование гидрогеля завершилось.
   8. После гелеобразования аккуратно снимите перфторалкилированное предметное стекло. Гидрогель останется прикрепленным к покровному стеклу основания. ​
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для покровных стекол размером 18 мм x 8 мм для получения мембраны толщиной 12,7 мкм используйте ~7 мкл раствора прекурсора (рис. 1A, B). Использование больших объемов раствора прекурсора может привести к образованию гидрогеля под основным покровным стеклом. Это может привести к тому, что покровная крышка основания прилипнет к чашке Петри и сломается при попытке снятия. Кроме того, остатки гидрогеля под покровным стеклом проблематичны для микроскопии. Требуется бережное удаление нереактивного перфторалкилированного предметного стекла, так как быстрое удаление может повредить гидрогель.
   9. Поместите субстрат в чашку Петри размером 60 мм x 15 мм в указанную питательную среду. В данном случае в течение 24 часов использовали среду ATGN с добавлением 100 мкг/мл спектиномицина для B. subtilis или 100 мкг/мл ампициллина для E.coli при 37 °C.

7. Подготовка материала к клеточной экстракции

1. Подготовка держателя PDMS (полидиметилсилоксан)
   1. Склейте скотчем стопку из десяти покровных стекол размером 18 х 18 мм и приклейте эту стопку покровных стеблей к дну чашки Петри.
   2. Для изготовления держателей PDMS смешайте прекурсор PDMS и отвердитель в соотношении 10:1 в пластиковом стаканчике, дегазируйте смесь в вакуумном эксикаторе, а затем вылейте смесь в чашку Петри.
   3. Отверждение PDMS в течение 90 минут при 80 °C. Затем разрежьте обмотанный скотч блок, чтобы снять держатель PDMS, и поместите держатель PDMS на предметное стекло для более удобного использования при микроскопии.
2. Подготовка микрошприца и трубки
   1. Отрежьте 20 см трубки из ПТФЭ (политетрафторэтилена) (0,05 дюйма внутри) и прикрепите один конец трубки к шприцу объемом 100 мкл микролитра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При экстракции избегайте использования пипеток, так как извлечение высвобождающихся клеток с помощью наконечника пипетки может повредить поверхность гидрогеля и привести к загрязнению.

8. Деградация гидрогеля с помощью инструмента с узорчатой подсветкой

1. Включите микроскоп (см. Таблицу материалов). Затем включите инструмент подсветки с рисунком (см. Таблицу материалов).
2. Включите модуль аналогового и цифрового управления светодиодным источником света 365 нм. Далее включите модуль управления светодиодным источником света.
3. Откройте программное обеспечение микроскопа и программное обеспечение для инструмента узорчатого освещения. Когда откроется окно настройки оборудования, нажмите кнопку Загрузить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь будут загружены три устройства. (Камера стороннего производителя, модуль управления и инструмент подсветки с рисунком)
4. Нажмите кнопку «Пуск». Откроется окно программы для создания световых узоров. Выберите первый вариант, кнопку «Управление устройством», на левой боковой панели окна.
5. Откалибруйте инструмент для подсветки с рисунком.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка должна выполняться с тем же объективом микроскопа и фильтром, которые будут использоваться для воздействия света.
   1. Установите объектив микроскопа на 10-кратное увеличение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это увеличение обеспечивает достаточное рабочее расстояние между линзой микроскопа и поверхностью образца. Это также позволяет отслеживать и записывать процесс извлечения в режиме реального времени через окно изображения.
   2. Установите объектив и фильтр микроскопа на настройки, используемые для экспонирования света, и поместите калибровочное зеркало под микроскоп.
   3. В окне «Управление устройством» нажмите вкладку «Управление светодиодами». Включите светодиод #1 и установите интенсивность света на нужное число. В стандартных экспериментах с экстракцией это значение установлено на 60%.
   4. Нажмите на вкладку с названием продукта инструмента с узорчатой подсветкой в окне «Управление устройством». Затем нажмите кнопку «Показать сетку».
      ПРИМЕЧАНИЕ: На калибровочное зеркало будет спроецирована сетчатая диаграмма.
   5. Отрегулируйте фокусировку микроскопа и экспозицию камеры, чтобы получить высокое качество изображения сетки, и при необходимости поверните камеру, чтобы выровнять линии сетки параллельно рамке окна камеры.
   6. Нажмите кнопку «Мастер калибровки» под вкладкой с названием продукта инструмента с узорчатой подсветкой и следуйте инструкциям, предоставленным программным обеспечением в этом окне. ПРИМЕЧАНИЕ: Откроется окно настройки камеры стороннего производителя.
   7. Откроется окно выбора типа калибровки. Выберите «Автоматическая калибровка» и нажмите «Далее».
   8. Когда откроется окно Предварительная калибровка Настройка, следуйте инструкциям программного обеспечения и нажмите кнопку Далее.
   9. Когда откроется окно Информация о сопоставлении, сохраните эту калибровку в нужной папке. Для этого нужно указать дату, название микроскопа, линзу объектива и фильтр.
   10. После калибровки нажмите кнопку «Определение рабочей области» на вкладке с названием продукта инструмента с узорчатым освещением, чтобы при необходимости определить рабочую область инструмента с узорчатым освещением.
6. Секция Sequence Design для подготовки шаблонов.
   1. Нажмите кнопку «Дизайн последовательности» на левой боковой панели окна программы. Затем нажмите кнопку «Редактор последовательности профилей».
   2. Когда откроется окно «Редактор последовательностей профилей», выберите параметр «Новый профиль» в списке профилей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь будет открыто окно редактора узоров.
   3. Подготовьте желаемый узор для светового воздействия, выбрав различные формы и размеры узора или нарисовав узор вручную, если это необходимо.
   4. Для круговых и ломаных крестообразных узоров для объемного гидрогеля выполните шаги 8.6.5-8.6.6
   5. Для круговых узоров определите круг диаметром 30 мкм над целевой колонией бактерий, чтобы покрыть всю колонию. Выберите цвет заливки фигуры белым.
   6. Для узоров ломаного креста выберите форму прямоугольника в окне рисования узора размером 3 м x 8 мкм. Поместите четыре прямоугольника с этими размерами по краям целевой колонии, в то время как половина узоров будет наложена на колонию.
   7. Для получения круглых и кольцевых шаблонов для массивов микролунок выполните шаги 8.6.8-8.6.10.
   8. Для узоров кругов нарисуйте круг диаметром 10 мкм по периметру скважины. Выберите цвет заливки фигуры белым.
   9. Для узора кольца нарисуйте круг диаметром 20 мкм, поместите его над лункой и выберите форму заливки белого цвета.
   10. Нарисуйте еще один круг диаметром 10 мкм с формой заливки черного цвета и разместите его по периметру колодца.
7. Отредактируйте узор и измените формы в зависимости от желаемого метода извлечения. Убедитесь, что нужный узор существует в рабочей области инструмента узорчатого освещения.
8. Поместите образец в держатель PDMS и нанесите дозатор определенной среды поверх образца, чтобы предотвратить обезвоживание образца и обеспечить несущее решение для высвобождающихся клеток.
9. Затем замените его калибровочным зеркалом.
10. Отрегулируйте фокус микроскопа, чтобы получить четкое изображение колоний внутри гидрогеля. Осмотрите колонии, чтобы определить интересующую их колонию.
11. Здесь вы можете спроектировать световые узоры, в то время как вид с камеры показывает колонии внутри образца, чтобы протестировать различные шаблоны для извлечения клеток.
12. Сохраните заданный шаблон. После сохранения заданного шаблона выберите раздел «Управление сессией».
13. В этом разделе на вкладке с названием продукта инструмента с узорчатой подсветкой добавьте сохраненную последовательность.
14. После добавления последовательности выберите опцию имитации шаблона для просмотра и настройки для желаемого места экспозиции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь можно отрегулировать расположение образца, чтобы обеспечить точное проецирование рисунка в целевую область.
15. Далее отрегулируйте интенсивность света до 60% и время экспозиции до 40 с на вкладке управления светодиодами и запустите процесс экспозиции.
16. Контролируйте деградацию гидрогеля в режиме реального времени и в светлом поле, чтобы обеспечить высвобождение клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте никаких движений образца во время воздействия света, так как это может привести к деградации нежелательных участков гидрогеля, что приведет к перекрестному загрязнению.

9. Извлечение клеток

1. После воздействия света на 365 нм и высвобождения клеток клетки собирают с помощью микролитрового шприца и микрофлюидной трубки (рис. 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Забор клеток должен быть выполнен сразу после воздействия паттерна. Это позволяет локализовать восстановление клеток до того, как высвобожденные клетки отойдут от облученной области.
2. Измените режим микроскопа со светлого поля на фильтр FITC или TRITC, чтобы обеспечить визуализацию экспонированной области образца невооруженным глазом.
3. Как только открытая область будет обнаружена, поместите конец трубки на облученное место. Затем переключите фильтр микроскопа обратно на светлое поле, чтобы отслеживать извлечение клеток в режиме реального времени.
4. С помощью шприца, прикрепленного к другому концу трубки, осторожно извлеките высвободившиеся клетки. Извлеките 200 мкл раствора и вставьте раствор в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл для анализа ДНК или нанесения покрытия.

Results

Рисунок 1: Образование гидрогеля на покровных стеклах из тиолированного стекла. (А) Распорки толщиной 12,7 мкм размещаются на двух противоположных сторонах основного покровного стекла, содержащего реакционноспособные тиоловые группы. (В) Рас...

Materials