Количественное определение бактериального альгината с помощью анализа карбазола уроновой кислоты

Аннотация

Источник: Al Ahmar, R., et al. Культура мелкого колониального варианта Pseudomonas aeruginosa и количественное определение его альгината. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео демонстрируется колориметрический анализ для количественного определения альгината, продуцируемого Pseudomonas aeruginosa, с использованием карбазола для обнаружения уроновых кислот после кислотного гидролиза. Метод позволяет проводить сравнительный анализ производства альгината, нормализованного по бактериальной биомассе, в научных и клинических исследованиях.

Протокол

1. Анализ на карбазол уроновой кислоты

1. Определите одну колонию из чистой культуры нужного штамма, подлежащего тестированию. Используя стерильную зубочистку, извлеките колонию и поместите зубочистку в культуральную пробирку, содержащую 5 мл отвара для выделения Pseudomonas (PIB). Выращивать в вибростенде при температуре 37 °C в течение 24 часов.
   ЗАМЕТКА: Следующие штаммы, PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB и PAO581pyrD, выращивали на планшетах PIA (Pseudomonas isolation agar) или планшетах PIA с добавлением 0,1 мМ урацила для сбора альгината для измерения.
2. На предварительно подогретую пластину PIA добавьте 150 μл кисломолочного бульона PIB (для пластин 15 мм x 100 мм) или 450 μл бульона (для пластин 15 мм x 150 мм). С помощью разбрасывателя стерильных клеток распределите бульон по тарелке. Выращивайте тарелку при температуре 37 °C в течение 24 часов.
   ЗАМЕТКА: Отсадите лишнюю жидкость, если таковая имеется, из планшета с помощью пипетки, наклонив пластину в одну сторону. Планшеты PIB и PIA, используемые в протоколе, содержат 20 мл/л глицерина, который клетки используют в качестве источника углерода для помощи в производстве альгината.
3. С помощью контроллера дозатора и стерильной пипетки объемом 50 мл добавьте 0,85% NaCl (хлорид натрия) на газон и соберите образец, соскребая планшет с помощью распределителя клеток. Отсадите образец с помощью свежей пипетки объемом 50 мл в пробирку для сбора 50 мл. Нанесите образец на высокую мощность, чтобы перемешать и поместите образцы на лед.
   ЗАМЕТКА: Объем добавляемого 0,85% NaCl варьируется в зависимости от размера пластины. Для пластин размером 15 мм x 100 мм используйте 10−30 мл, а для пластин 15 мм x 150 мм используйте 20−50 мл.
4. Измерьте оптическую плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр₆₀₀) образцов, добавив 1 мл образца в одноразовую кювету и ссчитав наружный диаметр с помощью спектрофотометра. Повторите этот шаг 2 раза, чтобы получить тройное количество прочтений для каждого образца.
5. Добавьте 3 мл раствора серной кислоты/бората в пробирки с культурой и дайте ему отстояться на льду. Медленно добавьте 350 мкл собранного образца в кислотную смесь в пробирках и кратковременно опустите на слабый уровень.
   1. Приготовьте боратный бульон, добавив 10,099 г порошка гидроксида калия (KOH) в 45 мл воды. Добавьте в смесь 24,74 г борной кислоты (Н₃БО₃) и доведите объем до 100 мл.
   2. Поместите бутылку объемом 1 л в раковину со льдом и наполните ее 500 мл концентрированной серной кислоты. МЕДЛЕННО добавьте 15 мл подготовленного боратного бульона. Дайте бутылке остыть.
   3. Добавьте еще 10 мл боратного бульона, всего 25 мл. Как только бутылка остынет, доведите объем до 1 л.
      ОСТОРОЖНОСТЬ: Этот метод основан на использовании высококонцентрированной серной кислоты. Для обеспечения безопасности следует использовать надлежащие средства индивидуальной защиты, а также следовать надлежащему протоколу утилизации пробы.
      ЗАМЕТКА: Для положительного контроля известную концентрацию D-маннуроновой кислоты и/или известный образец бактериального альгината собирают и очищают с помощью альгинат-продуцирующих штаммов P. aeruginosa (например, PAO581-PAO1mucA25). Для отрицательного контроля используйте 0,85% раствор NaCl и/илиPAO1Δ algD (делеция гена algD в кадре, которая делает бактерии полностью неспособными производить альгинат). Из каждого образца может быть изготовлено несколько пробирок, чтобы увеличить количество технических повторений и помочь в статистическом анализе. Подготовьте по 3−5 пробирок каждого образца.
6. Добавьте 100 мкл 0,1% карбазола в растворе этанола в смесь кислоты и образца. Закройте трубку и затвор на среднем уровне на 5 секунд. Поставьте в сухую ванну при температуре 55 °C на 30 минут.
7. После инкубации извлеките трубки и ненадолго переведите вихрь на высокую мощность и дайте остыть в течение 5 минут.
   ЗАМЕТКА: Цвет, который будет виден, будет оттенком фиолетового. Цвет будет оставаться стабильным при измерении в течение 1−2 ч.
8. Считайте внешний диаметр₅₃₀ каждой пробирки, добавив 1 мл смеси в чистую кювету и считывая внешний диаметр образцов с длиной волны 530 нм на спектрофотометре. Используйте пробирку с 0,85% NaCl в качестве заготовки в спектрофотометре.
9. Подготовьте стандартную кривую, измерив наружный диаметр₅₃₀ серийных разведений известных концентраций D-маннуроновой кислоты (1 024 мкг/мл, 512 мкг/мл, 256 мкг/мл, 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, 32 мкг/мл, 16 мкг/мл и 8 мкг/мл). Повторите 2 раза. Извлеките из этих показаний линейное уравнение.
   ЗАМЕТКА: Стандартную кривую нужно сделать только один раз. Извлеченное из него линейное уравнение может быть использовано для последующего тестирования.
   1. Рассчитайте концентрацию альгината в каждом образце с помощью стандартной кривой и разделите концентрацию альгината из линейного уравнения на наружный диаметр₆₀₀ , чтобы получить общее количество альгината на наружный диаметр₆₀₀.

Материалы