$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ИФА для количественного определения альгината
1. С помощью микропипетки добавьте 50 мкл собранного образца в необработанный 96-луночный планшет. Добавьте в лунки 50 мкл буфера для покрытия (карбонатный/бикарбонатный буфер pH 9,6). Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в течение 2 ч.
ЗАМЕТКА: Для положительного контроля можно использовать известную концентрацию D-маннуроновой кислоты и/или известный стабильный альгинат-продуцирующий штамм (например, PAO581-PAO1mucA25). Для отрицательного контроля используйте 0,85% раствор NaCl и/илиPAO1Δ algD (делеция гена algD в кадре делает бактерии полностью неспособными производить какой-либо альгинат). Из каждого образца может быть изготовлено несколько скважин, чтобы увеличить количество технических повторов и помочь в статистическом анализе. Подготовьте по 3−5 лунок каждой пробы.
2. С помощью пульверизатора промойте лунки пластины 2 раза 1x фосфатно-солевой буфером (PBS) с 0,05% Tween 20 (PBS-T), заполнив лунки, а затем слейте их, перевернув пластину.
3. С помощью микропипетки добавьте в лунки 200 мкл блокирующего буфера (10% обезжиренного молока в PBS-T). Инкубировать при температуре 4 °C в течение ночи.
ЗАМЕТКА: Оберните тарелку парафиновой пленкой или термоусадочной пленкой, чтобы избежать испарения в холодильнике.
4. С помощью пульверизатора 2 раза промойте лунки пластины PBS-T, заполнив лунки, а затем слейте их, перевернув пластину.
5. С помощью микропипетки добавить в лунки 100 мкл разведенного первичного антитела (мышиного антиальгинатного моноклонального антитела) и инкубировать при 37 °С в течение 1−2 ч.
ЗАМЕТКА: Первичное антитело (мышиное антиальгинатное моноклональное антитело) получали в концентрации 0,5 мкг/мл (разведение 1:2000 1 мг/мл запаса) в растворе разбавителя антител (1% обезжиренное молоко в 1x PBS).
6. С помощью пульверизатора 3 раза промойте лунки пластины PBS-T, заполнив лунки, а затем слейте их, перевернув пластину.
7. С помощью микропипетки добавить в лунки 100 мкл разведенного вторичного антитела и инкубировать при 37 °С в течение 1−2 ч.
ЗАМЕТКА: В качестве вторичного антитела использовали антитело против мышиной полихренпероксидазы (HRP) в концентрации 0,25 мкг/мл (разведение 1:2000 0,5 мг/мл) в растворе разбавителя антитела.
8. С помощью пульверизатора 3 раза промойте лунки пластины PBS-T, заполнив лунки, а затем слейте их, перевернув пластину.
9. С помощью микропипетки добавьте 100 мкл раствора TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидин)-ИФА (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (Таблица материалов) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.
ЗАМЕТКА: Цветом положительной реакции будет оттенок синего.
10. С помощью микропипетки добавьте 100 мкл стоп-раствора (2 Н серной кислоты).
ЗАМЕТКА: При добавлении стоп-раствора цвет изменится с синего на желтый. Цвет стабилен в течение 30 минут после остановки реакции.
11. С помощью считывателя пластин считайте внешний диаметр на длине волны 450 нм.
12. Постройте стандартную кривую путем измерения наружного диаметра450 серийных разведений известных концентраций D-маннуроновой кислоты (1 024 мкг/мл, 512 мкг/мл, 256 мкг/мл, 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, 32 мкг/мл, 16 мкг/мл и 8 мкг/мл). Повторите 2 раза. Из этих показаний извлеките линейное уравнение.
ЗАМЕТКА: Стандартную кривую нужно сделать только один раз. Извлеченное из него линейное уравнение может быть использовано для последующего тестирования.
1. Рассчитайте концентрацию альгината в каждом образце с помощью стандартной кривой и разделите концентрацию альгината из линейного уравнения на наружный диаметр600 , чтобы получить общее количество альгината на наружный диаметр600.