Моделирование колонизации влагалища мышей анаэробными бактериями

Аннотация

Источник: Morrill, S. R., et al. Модели колонизации влагалища мышей анаэробно выращенными бактериями. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется протокол моделирования вагинальной колонизации у мышей с использованием устойчивых к антибиотикам анаэробных бактерий. Он начинается с гормонального лечения для повышения восприимчивости эпителия, за которым следует вагинальная инокуляция и совместная инокуляция в анаэробных условиях. Процедура завершается забором проб и культивированием после инокуляции для оценки бактериальной колонизации и образования биопленки.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Приготовление посевного материала

ЗАМЕТКА: В этом разделе приведены общие этапы приготовления инокулята из анаэробно выращенной стрептомицин-резистентной Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR. Все шаги в этом разделе следует выполнять в анаэробной камере.

1. Переведите любые реагенты, включая приготовленный бульон Нью-Йорка III (NYCIII), агар и фосфатно-солевой буфер (PBS), в анаэробную камеру для балансировки в течение не менее 24 часов перед использованием.
   ЗАМЕТКА: Здесь была использована виниловая анаэробная камера, уравновешенная 5% газовой смесью водорода. Внутренняя концентрация кислорода обычно находится на уровне 0 ppm, хотя при циклической подаче материалов в камеру может наблюдаться небольшое переходное увеличение (10-25 ppm).
2. За два дня до вагинальной инокуляции выведите гарднереллу из замороженного глицеринового бульона на агаровую пластину NYC III в анаэробной камере. Используйте небольшой контейнер (например, пустую коробку из-под наконечника для дозатора), наполненный сухим льдом, чтобы запас глицерина оставался замороженным во время транспортировки в камеру и из нее.
3. За 1 день до вагинальной инокуляции используйте 5-10 отдельных колоний Gardnerella из планшета для инокуляции 10 мл бульона NYC III. Дайте жидкой культуре вырасти в течение ночи в течение 16 часов при 37 °C. Добавьте вторую 1 мл аликвоты питательной среды, которая осталась неинокулированной, и инкубируйте ее вместе с инокулированной культурой, чтобы убедиться, что среда не загрязнена.
4. Приготовьте посевной материал из жидкой культуры, как описано ниже. Как можно больше выполняйте подготовку инокулюма в анаэробной камере.
   1. Определите оптическую плотность культуры (OD) путем добавления 200 мкл культуры к 800 мкл свежей среды в кювете объемом 1,5 мл (разведение 1:5). С помощью спектрофотометра измерьте плотность (OD) разведенной культуры на длине волны 600 нм (используйте отдельную кювету только со свежей средой в качестве заготовки). Умножьте показания наружного диаметра на 5, чтобы получить фактический наружный диаметр₆₀₀ для культуры за 16 часов.
   2. Рассчитайте объем инокулята, необходимый для проведения эксперимента. Например, чтобы заразить 15 мышей инокулюмом 20 мкл на мышь, необходимо 15 х 20 мкл = 300 мкл инокулюма. Приготовьте примерно на 25% больше инокулята, чем нужно, поэтому для 15 мышей приготовьте 300 мкл + (0,25 x 300 мкл) = 375 мкл инокулята.
   3. Используя внешний диаметр₆₀₀ , определенный на шаге 1.4.1, рассчитайте объем 16-часовой культуры, которую необходимо раскрутить и ресуспендировать, чтобы получить инокулюм наружного диаметра₆₀₀ = 5,0 в объеме, рассчитанном на шаге 1.4.2. Например, если внешний диаметр₆₀₀ культуры равен 1,5, а необходимый объем инокулята составляет 375 мкл, то объем культуры, подлежащей прядению, составляет (375 мкл x 5)/1,5 = 1250 мкл.
   4. Пипетка в объеме культуры, рассчитанном на шаге 1.4.3. в стерильную микроцентрифужную пробирку. Гранулируйте бактерии центрифугированием при давлении 16 000 x g в течение 1-3 минут.
   5. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в анаэробной PBS в объеме, рассчитанном на шаге 1.4.2. Теперь инокулят будет иметь расчетный внешний диаметр₆₀₀ 5,0. Если применимо, также подготовьте пробирку PBS, которая будет служить в качестве контрольного средства для мышей в неинфицированной контрольной группе.
5. Перед извлечением инокулюмной пробирки из анаэробной камеры приготовьте серию серийного разведения от 1:10 до 1:10 x 10⁶ в PBS. Пятнистая пластина 5 воспроизводит каждое разведение на агаровой пластине с использованием многоканальной пипетки для определения колониеобразующих единиц или КОЕ инокулюма. Это КОЕ перед прививкой.
6. Вагинальный предварительный лаваж и инокуляция гарднереллой
   1. Приготовьте вагинальный промывку/промывочные зонды в анаэробной камере. Пипетка 70 мкл стерильного анаэробного PBS в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, помеченные номерами мышей. Подготовьте одну пробирку для мытья каждой мыши. Плотно закройте трубки и выведите их из анаэробной камеры.
   2. Проведите вагинальный промывание каждой мыши с 50 мкл анаэробного PBS из отдельных пробирок, приготовленных на шаге 2.1. Эти вагинальные промывания представляют собой промывания перед инокуляцией и могут использоваться для последующих измерений и анализов.
      1. После введения второй инъекции β-эстрадиола валерата поместите каждую мышь на клетку или чистую твердую поверхность, за которую она может ухватиться передними лапами. Аккуратно возьмитесь за среднюю часть хвоста и поднимите его так, чтобы задние конечности были немного приподняты, а вход во влагалище был открыт.
      2. С помощью пипетки и наконечника фильтра p-200 наберите 50 μL PBS из промывочной трубки, соответствующей соответствующей мыши. Аккуратно введите наконечник пипетки в просвет влагалища ~2-3 мм и аккуратно введите и выведите объем 50 мкл внутрь и наружу, в 3-4 раза.
      3. Переложите собранный материал для промывки (~50 мкл) обратно в ту же промывочную трубку, из которой он был получен, пипетируя вверх и вниз в промывочной трубке, которая все еще содержит оставшиеся 20 мкл PBS. Если имеется чрезмерное количество слизи и наконечник засоряется, используйте чистый наконечник p200, чтобы собрать остатки материала и поместить его в ту же промывочную трубку.
   3. Вагинально введите 20 мкл концентрированной бактериальной суспензии или средства контроля во влагалище каждой мыши. Сделайте прививку каждой мыши сразу после вагинального промывания для этой мыши (т.е. выполняйте промывание и инокуляцию последовательно для каждой мыши, прежде чем переходить к следующей). Чтобы упростить этот процесс, используйте две пипетки p200 — одну на 50 мкл для промывки, а другую на 20 мкл для посева.
      1. Ограничьте мышь, как описано в шаге 2.2.1. С помощью наконечника p-200 впрыскайте во влагалище 20 μл бактериальной суспензии. Для экспериментов по совместному инокуляции с использованием двух разных видов/штаммов бактерий используйте по 10 мкл каждой бактериальной суспензии и избегайте смешивания двух штаммов до инокуляции.
         ЗАМЕТКА: Общий объем посева не должен превышать 20 μл, чтобы избежать вытекания из влагалища.
      2. Продолжайте удерживать задний конец каждой мыши в течение 10-20 с, чтобы предотвратить немедленное скопление введенного объема в влагалищном интроитусе. Затем поместите мышь в новую клетку/емкость или с уже привитыми соседями по клетке.
      3. Повторите шаг 2.2. и шаг 2.3. для каждой мыши. Никогда не помещайте мышей обратно в клетку с животными, которые еще не были привиты. Это предотвращает случайное воздействие на мышей стрептомицин-резистентных бактерий до инокуляции.
   4. После того, как все мыши будут привиты, пробирку с инокулюмом обратно в анаэробную камеру. Приготовьте и закалывайте еще одно серийное разведение, как описано в шаге 1.5. Это постинокуляционный КОЕ. Сравните КОЕ из планшетов после инокуляции и до инокуляции, чтобы определить, снизилась ли жизнеспособность инокулюма за пределами анаэробной камеры во время инокуляции животных.
   5. Нанесите на планшет вагинальные промыватели, собранные на шаге 2.2. на селективный агар (в данном случае 1 мг/мл стрептомицина). Инкубируйте планшеты в течение 1-2 дней в анаэробной камере при температуре 37 °C и осмотрите на предмет роста. Примечание: Рост указывает на то, что эндогенные члены микробиома устойчивы к маркеру отбора и, следовательно, могут затемнять перечисление КОЕ целевого организма.
7. Забор вагинальных промываний для определения жизнеспособной колонизации Gardnerella
   1. Соберите данные о вагинальных смывателях в выбранные моменты времени, чтобы проанализировать вагинальную колонизацию. Соберите, как описано в шаге 2.2.
   2. Сразу после сбора циклически проведите вагинальные промывки в анаэробной камере. Используйте 10 мкл каждого промывания для выполнения серийного разведения и нанесения покрытия на селективный агар, как описано в шаге 1.5. Используйте КОЕ в качестве меры вагинальной колонизации гарднереллой (или другим анаэробом, представляющим интерес).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
β-эстрадиол 17-валериат	Сигма	Е1631	эстрогенизация мышей
1x PBS	Рыбак	MT21040CM	промывание влагалища, подготовка посевного материала G. vaginlalis , забор тканей и гомогенизация
Анаэробная камера	Застенчивый	7200000	Рост анаэробных бактерий
Бакто-агар	Рыбак	DF0140074	Агаровые пластины G. vaginalis, F. nucleatum и P. bivia
Глюкоза	Сигма	Г7528	NYCIII средства для роста G. vaginalis
ХЕПЕС	Селлгро	25-060-Кл	NYCIII средства для роста G. vaginalis
Сыворотка для лошадей	Гемостат	SHS500	NYCIII средства для роста G. vaginalis
Газообразная смесь водорода (5% водорода, 10% CO₂, 85% азота)	Мэтисон		Газ для анаэробной камеры
Очиститель воды Milli-Q	Многородность	IQ-7000	для изготовления сред и гомогенизации
NaCl	Сигма	С3014	NYCIII средства для роста G. vaginalis
Газообразный азот	Воздушный газ		Газ для анаэробной камеры
Наконечники с фильтром P-200	Биография МУЦ	-1237-200	вагинальные промажи и бактериальные посевы
Кунжутное масло	Рыбак	ICN15662191	эстрогенизация мышей
Спектрофотометр	БиоХром	80-3000-45	измерение бактериального OD₆₀₀
Стрептомицин	Gibco	11860038	Добавить в агаровый материал для изготовления селективных пластин
Дрожжевой экстракт	Рыбак	ДФ0127-17-9	NYCIII средства для роста G. vaginalis