Локализованная доставка бактерий в просвет кишечника личинки данио-рерио с помощью микроинъекции

Аннотация

Источник: Li, J. et al. Разработка модели инфекции личинок рыбок данио для Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео показана доставка с помощью микроинъекций меченого флуоресцентно меченного Clostridioides difficile в просвет кишечника личинки данио-рерио, находящейся под наркозом. В нем описаны этапы, связанные с подготовкой личинок, бактериальной инъекцией и подтверждением локализации бактерий в кишечнике с помощью флуоресцентной микроскопии.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Введение окрашенного Clostridioides difficile личинкам данио-рерио

1. Обезболите 20–30 личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения (здесь они обозначаются как 5 dpf) 0,02%–0,04% трикаином (порошок трикаина растворяют в воде двойной дистилляции и доводят до pH = 7 1 М раствором Tris-HCL) в 30% среде Данио ~ 10 мин до инъекции. Перенесите обезболенных личинок в свежую 10-сантиметровую чашку Петри и удалите излишки 30% среды Дано.
2. Нанесите каплю 0,8% легкоплавкой агарозы на личинок данио-рерио, чтобы покрыть. Аккуратно отрегулируйте личинки в боковое положение. Поместите чашку Петри на лед на 30–60 с, чтобы легкоплавкая агароза застыла. Добавьте 30% среду Данио, содержащую 0,02–0,04% трикаина, чтобы покрыть агарозу.
3. Приготовьте раствор для инъекций. Добавьте 1 мкл 0,5% фенолового красного в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) в 9 мкл окрашенного красителем инокулума Clostridioides difficile для визуализации процесса инъекции.
4. Загрузите калиброванную иглу для микроинъекций с раствором для инъекций с помощью микрозагрузчика. Установите заряженную иглу на микроманипулятор и расположите ее под стереомикроскопом.
5. Отрегулируйте давление впрыска в диапазоне 600–900 гПа. Установите время введения 0,1–0,3 с для получения 0,5–1,0 нл. Установите иглу в микроманипулятор под углом ~45° в сторону внедренных личинок.
6. Поместите кончик иглы над желудочно-кишечным трактом, ближе к мочеполовой поре. Проколите через агарозу, затем мышцу кончиком иглы, затем введите ее в просвет кишечника и введите 0,5–1,0 нл Clostridioides difficile. Используйте флуоресцентный микроскоп для наблюдения за введенными личинками и выберите правильно введенных личинок для конфокальной визуализации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агароза легкоплавкая (LM)	Пронадиса	8050	Его используют в агарозных пластинах
BacLight Красное бактериальное пятно	Thermo Fisher Scientific	В35001	Флуоресцентный краситель
Капиллярное стекло	Гарвардский аппарат	30-0019	Иглы для инъекций
Clostridioides difficile			R20291, штамм риботипа 027, продукция TcdA+/TcdB+/CDT+
ДМСО	Карл Рот ГмбХ	А994
ФИДЖИ	Платформа с открытым исходным кодом		Обработка изображений
Микроинжектор	Эппендорф	5253000017
Конфокальный микроскоп Leica SP8	Лейка
Фенол красный	Сигма-Олдрич	П0290
Трикаин	Сигма-Олдрич	Е10521