Возрождение и рост молочнокислых бактерий

Аннотация

Источник: Айиви, Р. и др., Культивирование, рост и жизнеспособность молочнокислых бактерий: перспектива контроля качества. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется метод восстановления молочнокислых бактерий, подвергшихся холодовому стрессу, из замороженного глицеринового запаса, восстановления жизнеспособности бактерий с помощью анаэробной инкубации и выделения активных колоний для расширения культуры.

Протокол

1. Протокол активации и контроля качества культур молочнокислых бактерий (LAB)

1. Возьмите подготовленный глицериновый запас штаммов LAB (в центрифужных пробирках объемом 2 мл) из сверхнизкой морозильной камеры при температуре -80 °C и не дайте им оттаять перед использованием.
2. Очистите и продезинфицируйте отверстие пробирок центрифуги 70% спиртом, а перед использованием аккуратно продезинфицируйте.
3. Пипетируйте около 250 мкл (0,25 мл) исходной культуры LAB из центрифужных пробирок в свежие пробирки MRS (среды deMan, Rogosa и Sharpe) объемом 2 мл.
4. Осторожно сделайте вихревую пленку, парапленку из пробирок и анаэробно инкубируйте их в течение ночи при температуре 42 °C в течение 12-16 часов.
5. Возьмите около 500 мкл (0,5 мл) культур, выращенных за ночь, из пробирок MRS объемом 2 мл в свежие 7 мл пробирки MRS, вихревые, и анаэробно инкубируйте их в течение ночи при 42 °C в течение 12-16 ч.
6. Оцените рост микроорганизмов путем измерения оптической плотности (OD) или роста культур на длине волны 610 нм с помощью спектрофотометра в ультрафиолетовом диапазоне и записи приемлемых результатов в диапазоне от 0,7 до 0,9.
7. Ночные культуры из пробирок MRS объемом 7 мл поместите на агаровые планшеты MRS и MRCM-PYR (модифицированный усиленный клостридиальный среднепируват) и инкубируйте их анаэробно в течение 72 ч при 42 °C.
8. Изолированные колонии отбирают из агаровых планшетов, перекладывают в свежие 7 мл пробирок MRS, осторожно вортексируют и анаэробно инкубируют в течение ночи при 42 °C в течение 12-16 ч.
9. Агаровые пластины, содержащие выделенные штаммы, хранят при температуре 4 °C в холодильнике в течение недели.
10. Измерьте и подтвердите OD (в диапазоне от 0,7 до 0,9) из 7 мл пробирок MRS культур LAB, выделенных из полосатых планшетов с длиной волны 610 нм, и используйте их в качестве рабочих культур для всех соответствующих экспериментов.
11. Для получения соотношения 1:10 проводят десятикратное разведение (серийные разведения) выращенных культур LAB из последних 7 мл пробирок MRS с использованием 9 мл пептонной воды (физиологического буфера).
12. Наконец, возьмите около 250 мкл (0,25 мл) из соответствующих серийных разведений для всех экспериментов по ферментации.
13. Активируйте бульон, содержащий штаммы (250 мкл), начиная с шага 2.12, перенеся их в свежий бульон MRS объемом 7 мл и инкубируя анаэробно при 42 °C в течение 16 ч.
    ЗАМЕТКА: Все штаммы L. bulgaricus активировали в свежеприготовленном бульоне MRS, а затем инкубировали анаэробно при 42 °C в течение 16 ч для достижения оптической плотности (OD₆₁₀ нм) роста бактерий в диапазоне от 0,7 до 0,9. Рост бактерий измеряли с помощью УФ-видимого спектрофотометра с длиной волны 610 нм. Значения pH ночных культур находились в диапазоне от 3,5 до 5,3 в результате производства молочной кислоты, органического конечного продукта ферментации LAB. Были соблюдены и соблюдены такие процедуры безопасности, как надлежащая циркуляция воздушного потока в биозащитном колпаке и предотвращение ожогов при использовании горелки Бунзена.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Анилиновый синий	Термо Сайентиал	Р21526	25 г
Экстракт говядины	Research Products International	50-197-7509	500 г
Дрожжевой экстракт	Научный центр Фишера	БП1422-500	500 г
Дигидрат хлорида кальция	Научный центр Фишера	С79-500	500 г
Декстроза безводная	Научный центр Фишера	BP350500	500 г
D-фруктоза	АКРОС Органикс	AC161355000	500 г
Порошок агара Difco	Дифко	ДФ0812-07-1	2 кг
Агар TPY	Дифко	211921	500 г
Микроцентрифужная пробирка Eppendorf (микроцентрифуга Secure-Lock с защелкивающейся крышкой)	Научный центр Фишера	05-402-12	2 мл
Глицерин	Термо Сайентиал	PI17904	500 мл
Инфракрасный CO₂ инкубатор	Форма Научная
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Коллекция американских типовых культур (ATCC)	АТКС 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Болгария	С9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Болгария	ЛБ6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии (NCATSU)	ГАЛКА
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии (NCATSU)	Е22
Lactobacillus reuteri	Биогай, Роли / Лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии (NCATSU)	РД2
L-цистеина гидрохлорида моногидрат	Сигма-Олдрич	С6852-25Г	25 г
Мальтоза моногидрат	Научный центр Фишера	М75-100	100 г
Бульон MRS	Неоген	50-201-5691	5 кг
Пептон No3	Хах	50-199-6719	500 г
Двухосновной фосфат калия (K₂HPO₄)	Research Products International	50-712-761	500 г
Тригидрат ацетата натрия	Научный центр Фишера	С220-1	1 кг
Хлорид натрия	Научный центр Фишера	БП358-1	1 кг
Пируват натрия	Научный центр Фишера	БП356-100	100 г
Пробирки с завинчивающимися крышками с резиновой футеровкой	Научный центр Фишера	FB70125150	25 x 150 мм
Подросток 80	Научный центр Фишера	Т164-500	500 мл
Сверхнизкая морозильная камера	Так-Лоу
Урацил	АКРОС Органикс	AC157301000	100 г
УФ-видимый спектрофотометр	Thermo Fisher Scientific	Эволюция 201
Вихревой джинн 2	Научный центр Фишера
Дрожжевой экстракт	Научный центр Фишера	БП1422-500	500 г
Этанол	Научный центр Фишера	T08204K7	4 л
Соляная кислота (6N (сертифицированная), Fisher Chemical)	Научный центр Фишера	СА56-500	500 мл