Микробиологически индуцированное осаждение кальцита Sporosarcina pasteurii

Аннотация

Источник: Bhaduri, S., et al., Микробиологически индуцированное осаждение кальцита, опосредованное Sporosarcina pasteurii. J. vis. Exp. (2016)

В этом видео показан метод обогащения Sporosarcina pasteurii мочевиной и хлоридом кальция для запуска активности уреазы, что приводит к образованию видимых кристаллов кальцита с помощью микробиологически индуцированного осаждения кальцита, или MICP.

Протокол

1. Протокол обогащения питательными веществами для ускорения выпадения осадков

1. Переложите 9 мл приготовленной питательной жидкости (клетки + среда) в несколько стерилизованных пробирок центрифуги, каждая объемом 10 мл.
2. Приготовьте 100 мл стокового раствора наружного обогащения, состоящего из четырех компонентов в следующих концентрациях в свежей среде: мочевина: 2 г/л, хлорид аммония: 1 г/л, бикарбонат натрия: 212 мг/л, хлорид кальция: 280 мг/л. Тщательно отмерьте все ингредиенты с помощью аналитических весов и смешайте все, кроме мочевины, со свежей средой в стакане и поместите в автоклав (121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, 15 мин).
   1. После автоклава смешайте необходимое количество мочевины (2 мг) с 1 мл свежей среды и пропустите ее через шприц, оснащенный шприцевым фильтром 0,22 мкм, чтобы завершить процесс обогащения.
   2. Добавьте 1 мл этой обогащающей среды с добавками в стерилизованные центрифужные пробирки, содержащие 9 мл приготовленной питательной жидкости (клетки + среда).
      ЗАМЕТКА: Мочевина, будучи разлагаемой при повышенных температурах, не может быть стерилизована в автоклаве. Следовательно, после автоклавирования других компонентов (121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, 15 минут) мочевина добавляется в последнюю очередь через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
3. Тщательно проведите вихревую обработку каждой трубки с помощью механического вихревого аппарата. Поместите обогащенные жидкости (ячейки + среда + добавки) в невстряхивающий инкубатор при температуре 30 °C. Регулярно контролируйте все единицы на предмет начала выпадения осадка. Используя световой микроскоп, начинайте микроскопические наблюдения после того, как начало осадков будет обнаружено невооруженным глазом. Обычно это происходит через 30-36 часов после начала экспериментов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Колбы Pyrex	Научный центр Фишера	С63268	Корнинг Эрленмейер
Измерительный цилиндр	Коул-Пармер	CP08559GC	Градуированный цилиндр Cole-Parmer класса А с сертификатом Cal, TC; 1000 мл,1/шт
Аналитические весы	ОХАУС	АХ124Е	Используется для измерения массы реагентов
Автоклав	Бринкманн	58619000
Автоклавная лента	ВВР	52428864
Алюминиевая фольга	Сигма-Олдрич	Z185140	Используется для запечатывания колбы перед помещением ее в автоклав
Бактериальный подвой	Седарлейн	11859	-80°C поголовья S. pasteurii, ATCC No. упоминается против Кэт. Нет.
Одноканальные механические дозаторы Mline, переменного объема	Биохит	725010	Продается компанией VWR под каталожным номером 14005976
Наконечник для микропипетки	Научный центр Фишера	No 212772Б	Используется для царапания агаровых пластин
Инкубатор	Сноповязалка	80079098	Микробиологический инкубатор, серия BF
Встряхивающий инкубатор	ВВР	14004300	Фирменные настольные встряхивающие инкубаторы VWR
Парафильм	Сигма-Олдрич	П7793	Используется для герметизации агаровых пластин
Мочевина	Сигма-Олдрич	У1250	Обогащение питательной средой
Бикарбонат натрия	Сигма-Олдрич	С8875	Обогащение питательной средой
Хлорид кальция	Сигма-Олдрич	С1016	Обогащение питательной средой