$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Посев полимерных микрочипов бактериями
ЗАМЕТКА: Обеспечьте хорошую асептическую технику. Все операции с культурами должны выполняться в стерильной среде: либо с помощью горелки Бунзена, либо в проточной вытяжке. Культуры должны выращиваться с доступностью кислорода, питательной средой и температурой, адаптированными к требованиям каждого вида.
- Приготовьте ночные культуры, введя 5 мл бульона Лурии-Бертани (LB: 10 г/л бакто-триптона, 5 г/л хлорида натрия, NaCl и 10 г/л дрожжевого экстракта) колонией из тарелки. Выдерживать в течение ночи при температуре 37 °C, встряхивая со скоростью 200 об/мин (оборотов в минуту).
- Подготовьте запасы культур на ночь в морозильной камере с добавлением глицерина (общая концентрация 10%) и храните их при температуре -80 °C.
- Чтобы определить количество клеток по образцам размороженных бактериальных запасов, выполните серийное разведение каждого запаса и выращивайте бактерии в течение ночи на твердой среде. Точное определение количества клеток в запасах обеспечивает надлежащую инокуляцию каждого вида.
- Подготовьте инокуляцию для микрочипа. Одновидовые культуры выращивают, как описано выше, и наносят непосредственно на микрочипы. BacMix-1 представляет собой бактериальную смесь Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) и Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 представляет собой бактериальную смесь, состоящую из Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae и Enterococcus faecalis (E. faecalis).
- Чтобы получить любую смешанную культуру, перемешайте в течение ночи в равных объемах (по 3 мл каждый) и разбавьте в четыре раза свежим LB (примерно до 50 мл конечного объема).
- Стерилизованные ультрафиолетом полимерные микрочипы помещают в прямоугольные 4-луночные планшеты и инкубируют их с 6 мл смешанных бактериальных культур при 37 °C с бережным перемешиванием (30 об/мин) в течение 5 дней.
- После инкубации микрочипы дважды промыть фосфатно-соевым буфером (PBS: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ хлорида калия, KCl, 10 мМ динатрия гидрофосфата, Na2HPO4, 1,8 мМ дигидрофосфата калия, KH2PO4) и инкубировать с раствором 1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в PBS в течение 30 мин.
- Промойте испачканные предметные стекла микрочипа в свежей лунной пластине, накрыв PBS и осторожно поворачивая, меняя PBS один раз. Сушите под потоком воздуха. Приложите к предметному стеклу микрочипа защитный лист и заклейте клеем. После высыхания простерилизуйте внешнюю поверхность с помощью этанола 70% (v/v).
- Безопасно утилизируйте культуры в соответствии с уровнем их содержания.
2. Визуализация и анализ микрочипов
- Получение отдельных изображений для каждого полимерного пятна в светлопольных каналах и каналах DAPI (возбуждение/излучение, Ex/Em = 358 нм / 361 нм). Выполните это вручную с помощью флуоресцентного микроскопа или с помощью автоматического флуоресцентного микроскопа (со столиком X-Y-Z, управляемым программным обеспечением для получения изображений), оснащенного 20-кратным объективом.
ЗАМЕТКА: Настройте микроскоп для получения изображений с использованием светлого поля и каналов DAPI. Убедитесь, что коэффициент усиления и время экспозиции для захвата изображения для всех микрочипов одинаковы. - Получите среднюю интенсивность флуоресценции для каждого пятна в канале DAPI, выбрав область пятна и количественно оценив флуоресценцию с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
- Для фоновой флуоресценции каждого пятна получите изображения полимерных пятен на репликатном микрочипе, инкубированном только со средами без бактерий. Вычтите фоновую флуоресценцию из интенсивности пятна, чтобы получить флуоресценцию от бактерий.
- Рассчитайте среднее нормализованное значение по четырем точкам, представляющим каждый полимер, используемый для сравнения связывания бактерий различных полимеров.
- Определите полимеры, которые демонстрируют наименьшее связывание с бактериями (самую низкую флуоресценцию) как «пораженные» полимеры.