Выделение устойчивых к антибиотикам бактерий из пробы воды для молекулярного анализа

Аннотация

Источник: Гадигаонкар, Д. и Рат, А. Выделение и идентификация устойчивых к антибиотикам бактерий, переносимых через воду, и молекулярная характеристика их генов устойчивости к антибиотикам. J. Vis. Exp. (2023)

В этом видео демонстрируется выделение и подготовка устойчивых к антибиотикам бактерий из пробы воды с использованием селективных сред. ДНК извлекается из устойчивых к антибиотикам бактерий и амплифицируется для идентификации бактериальных генов, устойчивых к антибиотикам.

Протокол

1. Сбор и обработка образцов

1. Забор образцов
   1. Соберите соответствующий объем пробы воды в стерильные контейнеры для проб, следя за тем, чтобы емкость была заполнена не более чем на 3/4.
   2. Транспортируйте образцы в лабораторию в асептических условиях как можно скорее после сбора и немедленно обрабатывайте их.
2. Обработка образцов
   1. Асептически отфильтруйте пробу воды через стерильную муслиновую ткань, чтобы удалить любые твердые частицы.
   2. Проведите соответствующие серийные разведения отфильтрованной воды для дальнейшего анализа.

2. Оценка общей бактериальной нагрузки и количества устойчивых к антибиотикам бактерий

1. Определение общей бактериальной нагрузки
   1. Суспензируйте 18,12 г модифицированного порошка агара Reasoner's 2A (R2A agar) в 1000 мл воды двойной дистилляции и растворите смесь путем нагревания. Автоклавируйте растворенную смесь при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм (фунт/кв. дюйм) в течение 20 мин. Приготовьте модифицированные агаровые пластины R2A, налив соответствующее количество автоклавированной смеси в стерильные чашки Петри (например, добавьте приблизительно 20 мл автоклавированной стерильной среды в 90-миллиметровую стерильную чашку Петри).
   2. Как только среда затвердеет, равномерно распределите 100 мкл соответствующих разбавлений отфильтрованной пробы воды на пластине R2A Agar, Modified. Проведите эксперимент в двух экземплярах.
   3. Инкубируйте все вышеуказанные планшеты при температуре 35 - 37 °C в течение 48 часов (варьируйте температуру и время инкубации в зависимости от среды, используемой для выделения).
   4. Выразите общую бактериальную нагрузку в единицах колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл) с помощью уравнения (1):
2. Определение количества бактерий AR
   1. Выполните шаги 2.1.1-2.1.4. Однако вместо R2A Agar, Modified plates, используйте R2A Agar, Modified plates, дополненные по отдельности пятью различными антибиотиками, а именно: цефотаксим (3 мкг/мл), ципрофлоксацин (0,5 мкг/мл), эритромицин (20 мкг/мл), канамицин (15 мкг/мл) и ванкомицин (3 мкг/мл).
   2. Добавьте антибиотики по отдельности в пробирки, содержащие 20 мл стерильного модифицированного расплавленного R2A агара (с температурой расплавленного R2A-агара, модифицированного при ≤40 °C) для достижения конечной концентрации антибиотика, как указано в шаге 2.2.1.
   3. Закрутите для равномерного перемешивания и вылейте на стерильные пластины Петри, пока агар не застыл. Проведите эксперимент в двух экземплярах.
   4. Инкубируйте все вышеуказанные планшеты при температуре 35 - 37 °C в течение 48 часов (температура и время инкубации могут меняться при использовании другой среды).
   5. Для контроля качества и проверки эффективности антибиотиков распределите 100 мкл бактериальных суспензий штаммов Escherichia coli ATCC 25922 и Staphylococcus aureus ATCC 29213 на соответствующие антибиотикосодержащие R2A агар, модифицированные планшеты (убедитесь, что плотность свежей культуры, используемой для посева, равна оптической плотности, OD = 0,5 при 600 нм).
   6. Определите количество устойчивых к антибиотикам бактерий в пересчете на КОЕ/мл, как описано в шаге 2.1.4.

3. Идентификация культивируемых бактерий с помощью секвенирования гена 16S рибосомальной РНК (рРНК)

1. Получение матрицы ДНК из изолятов для полимеразной цепной реакции (ПЦР)
   1. С помощью стерильной зубочистки возьмите одну, изолированную, чистую колонию изолята, растущего на пластине Петри. Суспензировать колонию бактерий в 100 мкл стерильной воды двойной дистилляции в стерильной микроцентрифужной пробирке и кипятить в течение 10 минут.
   2. Центрифугируйте суспензию при давлении 10 000 × г в течение 2 мин для гранулирования мусора и перенесите надосадочную жидкость в свежую стерильную микроцентрифужную пробирку для использования в качестве матрицы сырой ДНК.
2. Таргетная ПЦР-амплификация V3-области гена 16S рРНК и секвенирование
   1. Приготовьте 40 мкл реакционной смеси в ПЦР-пробирке для ПЦР-амплификации, как указано в таблице 1.
      ЗАМЕТКА: Препарат ДНК следует проводить на ледяной глыбе с минимизацией вероятности загрязнения (при работе с реагентами надевать перчатки, а рабочую поверхность тщательно очищать 70% этанолом).
   2. Поместите пробирку в термоблок, и запустите соответствующую программу в термоамплификаторе PCR. В таблице 2 приведены стандартизированные условия циклирования ПЦР и информация о праймере для амплификации V3-областей генов 16S рРНК.

Таблица 1: Составляющие мастермикса ПЦР. Реакционная смесь состава различных ПЦР-реагентов.

Реагенты для ПЦР	Объем (μл)
2x Taq Master Mix	20
Передний праймер (10 пико моли)	1.5
Обратный праймер (10 пико моли)	1.5
Сырая матрица ДНК	1.5
Стерильная молекулярная биология воды	15.5
Общий объем	40

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 2: Условия цикла ПЦР для амплификации гена 16S рРНК. Показаны условия цикла ПЦР, необходимые для амплификации гена 16S рРНК. Этапы включают в себя начальную стадию денатурации, за которой следуют 35 циклов денатурации, отжига и удлинения, а также заключительную стадию удлинения.

Направление	Последовательность грунтовок 5' – 3'	Условия ПЦР	Нет. циклов
Вперёд	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94 °C в течение 10 мин	1
		Денатурация при 94 °C в течение 30 с	35
		Отжиг при 50 °C в течение 30 с
		Удлинение при 72 °C в течение 40 с
Обратный	CTACCGGGGTATCTAATCC	Окончательное продление при 72 °C в течение 5 минут	1

Материалы