Система совместного культивирования для изучения молекулярных реакций растений-хозяев и взаимодействующих бактерий

Аннотация

Источник: Nathoo, N., et al. Гидропонная система совместного культивирования для одновременного и систематического анализа молекулярных взаимодействий растений и микробов и передачи сигналов. J. Vis. Exp. (2017).

В этом видео демонстрируется гидропонная система совместного культивирования для изучения взаимодействия растений и бактерий в стерильных условиях. Рассаду растений пересаживают в стерильную, кислую среду для выращивания, инкубируют и проверяют на загрязнение перед инокуляцией агробактерией. Активированные бактерии прикрепляются к корням растений, переносят Т-ДНК в клетки растений и способствуют молекулярным изменениям, которые усиливают бактериальную колонизацию.

Протокол

1. Гидропонная система совместного культивирования

1. Приготовьте жидкую среду Мурасиге и Скуга (МС): 2,165 г/л базальных солей МС, 10 г/л сахарозы, 0,25 г/л 2-(N-морфолин)этансульфоновой кислоты (MES) и 59 мл/л витаминной смеси B5, pH 5,75.
2. Автоклав среды. Налейте по 18 мл его в каждую стерильную цилиндрическую стеклянную или прозрачную пластиковую емкость (чашки для кристаллизации, 100 х 80 мм2) со стерильными крышками.
   ЗАМЕТКА: Предварительно простерилизуйте баки и крышки, завернув их в алюминиевую фольгу и автоклавирование.
3. В стерилизованном проточном колпаке с помощью стерильных щипцов аккуратно перенесите каждый квадрат сетки с 10-14-дневными саженцами из полутвердой среды в гидропонный цилиндрический резервуар (рис. 1d). Запечатайте крышки баков с помощью пористой хирургической ленты.
4. Выращивайте рассаду на сетке в резервуаре в течение 72 ч при температуре 22-24 °C, с фотопериодом 16 ч и встряхиванием при 50 об/мин для аэрации (рис. 1e).
   ЗАМЕТКА: Это позволяет растениям адаптироваться к гидропонной среде до инокуляции (совместного культивирования) с микроорганизмами. Этот период ожидания также позволит выявить случайное микробное загрязнение до прививки.
   1. Приступайте к следующему этапу за день до окончания инкубационного периода.
5. Выращивать Agrobacterium tumefaciens в среде агробактерий (АВ) (0,5% мас.в. дрожжевого экстракта, 0.5% в/в триптона, 0.5% в/в сахарозы, 50 мМ MgSO₄, рН 7.0) при 28 °С с встряхиванием в течение ночи до достижения культурой окончательной оптической плотности 1.0 при 600 нм (OD₆₀₀), измеренной с помощью спектрофотометра, с неинокулированной средой АВ в качестве заготовки.
   ЗАМЕТКА: Наружный диаметр₆₀₀ , равный 1,0, эквивалентен приблизительно 10⁹ клеток/мл.
6. Промойте A. tumefaciens три раза в равном объеме 0,85% NaCl. Суспендировать в равном объеме стерильную воду двойной дистилляции.
7. Перед прививкой внимательно осмотрите емкость с рассадой, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения; Среда в незагрязненных резервуарах должна быть прозрачной и прозрачной.
   1. Выбросьте любой бак с мутной жидкостью (загрязнением) и пронумеруйте остальные баки. Возьмите небольшое количество (20 мкл) гидропонной среды из каждого пронумерованного резервуара и поместите ее на чашку Петри, наполненную бульоном Лурия (LB). Инкубируйте блюдо при температуре 28 °C.
8. Немедленно добавьте 50 μL суспензии A. tumefaciens (примерно 5 x 10⁷ клеток, оцененных по OD₆₀₀) в каждый пронумерованный гидропонный бак. Совместное выращивание рассады Arabidopsis thaliana и A. tumefaciens при 22-24 °C с 16-часовым фотопериодом и встряхиванием при 50 об/мин (рис. 3f).
   1. Осмотрите пятнистую пластину LB из шага 1.7.1. После 12 и 28 ч инкубации для проверки стерильности резервуаров. При наличии какого-либо загрязнения не используйте соответствующий пронумерованный резервуар (завитый бактериями) для дальнейших последующих анализов.
9. При желании контролируйте рост A. tumefaciens через равные промежутки времени, извлекая образец среды из резервуара и измеряя наружный диаметр₆₀₀ с помощью спектрофотометра со средой из неинокулированного контроля в качестве заготовки (рис. 2).
   ЗАМЕТКА: Симптомы болезни растений должны проявиться через 7 дней (Рисунок 3).

Результаты

Рисунок 1: Гидропонная система совместного культивирования растений и микробов. Левая панель представляет собой блок-схему, описывающую шесть ключевых этапов сборки и эксплуатации гидропонной системы совместного выращивания. Правая панель демон...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Семена растения (Arabidopsis thaliana Col-0)	Центр биологических ресурсов Arabidopsis	КС7000	https://abrc.osu.edu/order-stocks
Бактерии (Agrobacterium tumefaciens C58)	Вашингтонский университет	Н/Д
Меченые бактерии	Внутри компании		Опционально, зависит от последующих анализов
Двойная дистиллированная вода	(различные)
Микропипетка	(различные)
Базальные соли Мурашиге и Скуга (MS)	Сигма-Олдрич	М5524
Сахароза	(различные)
МЧС	(различные)
Витаминная смесь В5	Сигма-Олдрич	Г1019
Фитоагар	(различные)
Глубокие чашки Петри	(различные)
Сетка из нержавеющей стали	Ферриер Вайр Гудс Компани Лтд	Н/Д	класс: 304; Количество ячеек: 40 × 40; Диаметр проволоки: 0,01
Микропористая лента, 1"	3 МИН.	1530-1
Суточная ростовая камера	(различные)
Цилиндрические стеклянные баки, 100 × 80 мм	Пирекс	3250	Можно использовать другие размеры, в этом случае может потребоваться корректировка содержания жидкости
Проточная вытяжка	(различные)
Щипцы	(различные)
Дрожжевой экстракт	(различные)
Триптон	(различные)
MgSO₄	(различные)
Встряхивающий инкубатор	(различные)