Приготовление сферопластов E. coli

Аннотация

Источник: Figueroa, D. M., et.al. Получение и визуализация бактериальных сферопластов и протопластов для характеристики локализации антимикробных пептидов. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется производство сферопластов Escherichia coli путем сначала ингибирования деления клеток для индуцирования филаментации, а затем ферментативного расщепления клеточной стенки. Процесс включает в себя контролируемое добавление хелатирующего агента, ДНКазы и осмотического стабилизатора для обеспечения надлежащего образования сферопластов и стабильности для микроскопических наблюдений.

Протокол

1. Приготовление раствора

1. Приготовьте 1 М Tris-Cl, pH 7,8, растворив 10,34 г Tris HCl и 4,17 г Tris OH в 50 мл dH₂O в колбе объемом 125 мл. Стерилизовать путем фильтрации через шприц-фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и хранить в конической пробирке при комнатной температуре.
2. Раствор А (20 мМ MgCl₂, 0,7 М сахарозы, 10 мМ Tris-Cl, pH 7,8) путем растворения 0,10 г MgCl₂ (95,2 г/моль) и 11,98 г сахарозы (342,3 г/моль) в 25 мл dH₂O в колбе объемом 125 мл. Добавьте 500 μл 1 М Tris-Cl (pH 7,8) и отрегулируйте объем до 50 мл. Стерилизовать путем фильтрации через шприц-фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и хранить в конической пробирке при комнатной температуре.
3. Раствор В (10 мМ MgCl₂, 0,8 М сахарозы, 10 мМ Tris-Cl, pH 7,8) путем растворения 0,05 г MgCl₂ (95,2 г/моль) и 13,69 г сахарозы (342,3 г/моль) в 25 мл dH₂О в колбе объемом 125 мл. Добавьте 500 μл 1 М Tris-Cl (pH 7,8) и отрегулируйте объем до 50 мл. Стерилизовать путем фильтрации через шприц-фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и хранить в конической пробирке при комнатной температуре.
4. Приготовьте 0,8 М сахарозы, растворив 13,69 г сахарозы (342,3 г/моль) в 50 мл dH₂O в колбе объемом 125 мл. Стерилизовать путем фильтрации через шприц-фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и хранить в конической пробирке при комнатной температуре.
5. Приготовьте 5 мг/мл дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы I) путем растворения 0,015 г ДНКазы I в 3 мл dH₂O в колбе объемом 50 мл. Стерилизовать путем фильтрации через шприц-фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм. Аликвотный раствор разложить по микрофуге и хранить при температуре -20 °С.
6. Приготовьте 0,125 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), pH 8,0, растворив 0,698 г дегидрата динатрия ЭДТА (372,2 г/моль) в 15 мл dH₂O в колбе объемом 125 мл. Стерилизовать путем фильтрации через шприц-фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и хранить в конической пробирке при комнатной температуре.
7. Приготовьте 600 мкг/мл цефалексина, растворив 0,03 г гидрата цефалексина (365,404 г/моль) в 50 мл dH₂O в колбе объемом 125 мл. Стерилизовать путем фильтрации через шприц-фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и хранить в конической пробирке при температуре 4 °C.
8. Приготовьте 5 мг/мл лизоцима, растворив 0,015 г лизоцима в 3 мл dH₂O в колбе объемом 50 мл. Стерилизовать путем фильтрации через шприц-фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм. Аликвотный раствор разложить по микрофуге и хранить при температуре -20 °С.
9. Приготовьте 3% w/v соевого бульона триптиказы (TSB), растворив 30 г TSB в 1 л dH₂O в колбе объемом 2 л. Разложите раствор по колбам, содержащим 25 мл или 100 мл TSB, для использования при получении сферопластов E. coli . Автоклавные колбы для стерилизации жидкой среды. Стерильный TSB можно хранить при комнатной температуре или при температуре 4 °C.

2. Подготовка ночного посева

ЗАМЕТКА: Выполняйте разделы 2-3, используя соответствующие стерильные техники. При желании, бактериальный штамм может содержать плазмиду для устойчивости к антибиотикам, чтобы уменьшить потенциальное загрязнение. При использовании штамма с устойчивостью к антибиотикам добавьте необходимые антибиотики в шагах 2.1 и 3.1–3.2.

1. Приготовьте культуру на ночь, собрав одну колонию бактерий с помощью стерильного наконечника для пипетки и поместив ее в культуральную пробирку объемом 14 мл, содержащую 2–3 мл 3% мас.% TSB. Инкубировать при температуре 37 °C, при этом встряхивая в течение 16–21 ч.

3. Получение грамотрицательных сферопластов E. coli

1. В колбе объемом 250 мл разведите ночную культуру в соотношении 1:100 в объеме 25 мл 3% по мас.% и инкубируйте бактериальный раствор при 37 °С, встряхивая в течение примерно 2,5 ч до тех пор, пока раствор не достигнет оптической плотности 0,5–0,8 при длине волны 600 нм. Измерьте оптическую плотность с помощью спектрофотометра.
2. В колбе объемом 250 мл разведите эту культуру в соотношении 1:10 в 30 мл 3% весового объема и инкубируйте при 37 °C, встряхивая в течение 2,5 ч в присутствии 60 г/мл цефалексина (347,4 г/моль) для получения одноклеточных нитей длиной около 50–150 мкм, которые можно наблюдать при 1000-кратном увеличении с помощью светового микроскопа (рис. 1B).
3. Соберите нити, центрифугируя бактериальный раствор при температуре 1 500 x g, 4 °C в течение 4 минут. Сцедите и выбросьте надосадочную жидкость, оставив гранулы.
4. Промойте нити, аккуратно добавив 1 мл 0,8 М сахарозы, стараясь не потревожить гранулы. Инкубируйте в течение 1 минуты, а затем выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы.
5. Добавьте в гранулу 150 мкл 1 М Tris-Cl (pH 7,8), 120 мкл 5 мг/мл лизоцима, 30 мкл 5 мг/мл ДНКазы I и 120 мкл 0,125 М ЭДТА в соответствующем порядке и инкубируйте раствор при комнатной температуре в течение 10 минут.
6. Постепенно добавляйте 1 мл раствора А в приготовленный в 1,5 минуты раствор с помощью микропипетки, осторожно помешивая раствор вручную. Инкубируйте раствор в течение 4 минут при комнатной температуре.
7. Налейте 7 мл 4 °C раствора B в две конические пробирки по 15 мл. Добавьте в каждый из этих двух тюбиков равное количество приготовленного в 3,6 раза. Центрифугируйте раствор при 1 500 x g, 4 °C в течение 4 минут.
8. С помощью серологической пипетки осторожно удалите все надсадочную жидкость, кроме 1-2 мл, не нарушая гранулу. Повторно суспендируйте гранулу, аккуратно пипетируя вверх и вниз с помощью микропипетки P1000. Визуально проверьте, чтобы увидеть образование сферопластов, наблюдая за образцом при 1000-кратном увеличении с помощью светового микроскопа (рис. 1C).
9. Храните сферопласты при температуре -20 °C до недели или до тех пор, пока они не пройдут 3 цикла замораживания-оттаивания.

Результаты

Рисунок 1: Репрезентативные изображения кишечной палочки. (A) бактерии E. coli, (B) E. coli змея и (C) E. coli spheroplast. Снимки б...

Материалы