$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Приготовление раствора
- Приготовьте 5 мг/мл лизоцима, растворив 0,015 г лизоцима в 3 мл dH2O в колбе объемом 50 мл. Стерилизовать путем фильтрации через шприц-фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм. Аликвотный раствор разложить по микрофуге и хранить при температуре -20 °С.
- Приготовьте 3% w/v соевого бульона триптиказы (TSB), растворив 30 г TSB в 1 л dH2O в колбе объемом 2 л. Разложите раствор по колбам, содержащим 100 мл TSB, для использования при получении протопластов B. megaterium . Автоклавные колбы для стерилизации жидкой среды. Стерильный TSB можно хранить при комнатной температуре или при температуре 4 °C.
- Приготовьте раствор С (1 М сахарозы, 0,04 М малеата, 0,04 М MgCl2, pH 6,5) путем растворения 34,23 г сахарозы (342,3 г/моль), 0,46 г малеиновой кислоты (116,07 г/моль) и 0,38 г MgCl2( 95,21 г/моль) в 100 мл dH2О в колбе объемом 250 мл. Отрегулируйте pH до 6,5. Стерилизовать путем фильтрации через шприц-фильтр диаметром 25 мм с мембраной 0,2 мкм и хранить в конической пробирке при комнатной температуре.
- Приготовьте 200 мл протопластовой среды, смешав 100 мл 3% мас.в. TSB и 100 мл раствора C в стеклянном флаконе объемом 1 л. В автоклаве стерилизовать раствор и хранить при комнатной температуре.
2. Получение грамположительных протопластов B. megaterium
- В колбе объемом 250 мл разведите ночную культуру 1:1000 в 100 мл 3% мас.% TSB и инкубируйте бактериальный раствор при 37 °C, встряхивая в течение примерно 4,5 ч до тех пор, пока раствор не достигнет оптической плотности 0,9-1,0 при 600 нм. Измерьте оптическую плотность с помощью спектрофотометра.
- Налейте жидкую культуру в две конические пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте при температуре 2 000 x g, 4 °C в течение 10 минут.
- С помощью серологической пипетки удалите надосадочную жидкость из обеих конических трубок. Повторно суспендируйте каждую гранулу в протопластовой среде объемом 2,5 мл и соедините ресуспендированные растворы в одну коническую трубку. Пипетку комбинированного ресуспендированного раствора в колбу объемом 125 мл.
- Добавьте 1 мл 5 мг/мл лизоцима и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C, одновременно встряхивая.
- Наблюдайте за ростом протопластов при 1000-кратном увеличении с помощью светового микроскопа, отмечая любые неровности, такие как бактерии, которые выглядят как набухшие палочки вместо сфер (Рисунок 1). С помощью серологической пипетки переведите раствор в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при температуре 2 000 x g, 4 °C в течение 10 минут.
- Сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в протопластовой среде объемом 5 мл. Храните протопласты при температуре -20 °C до недели или до тех пор, пока они не пройдут 3 цикла замораживания-оттаивания.
