Оценка трансцитоза кишечной палочки через монослои эпителия кишечника

Аннотация

Источник: Ислам, А., и др., Оценка кишечного трансцитоза изолятов бактериемии новорожденных Escherichia coli . J. Vis. Exp. (2023)

В этом видео показана процедура оценки трансцитоза кишечной кишечной палочки у новорожденных через монослои эпителия кишечника с использованием трансвелловых вставок, измерения электрического сопротивления и количественного определения бактерий.

Протокол

1. Инокуляция клеток (начало эксперимента)

1. Ровно через 2 часа удалите утренние бактериальные культуры из шейкера и центрифугируйте их в течение 10 минут (1 900 x g, 4 °C).
   ЗАМЕТКА: На всех последующих этапах держите все бактериальные взвеси на льду, чтобы свести к минимуму рост.
2. Ресуспендируйте бактериальные гранулы в питательной среде для тканей (ТКМ) без антибиотиков. С помощью спектрофотометра отрегулируйте оптическую плотность (OD) до 0,7-0,9 и дополнительно разбавьте ТКМ без антибиотиков до концентрации 1 x 10⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл (примерно 1:100 разведение). Используйте эту бактериальную суспензию для заражения каждой вставки 1 x 10⁵ КОЕ на 100 мкл объема.
3. Наклейте этикетку на трансвелл-планшет и заинфектируйте каждую вставку 100 μл модифицированного материала, отрегулированного по OD-модулю (всего 1 x 10⁵ КОЕ на вставку). В настоящее время анализ начался. Запишите время и запишите его как t = 0 ч.
4. Нанесите бактериальную суспензию инокулюма для количественного определения КОЕ/мл методом разбавления дорожки, нанеся 10 мкл аликвот на квадратные агаровые пластины LB.

2. Количественная оценка трансцитоза

1. Каждые 30 минут после инокуляции заполняйте новые лунки 500 μл ТКМ без антибиотиков. Перенесите вставки в эти новые лунки с помощью другого набора стерильных щипцов для каждого штамма бактерий.
2. Соберите среду из использованной сборной лунки для каждого вкладыша в отдельные пробирки с маркировкой. Поместите эти трубки на лед. В промежутках времени верните планшеты Transwell в инкубатор.
3. Для каждой вставки объедините собранные среды от t = 0,5 ч, t = 1 ч, t = 1,5 ч и t = 2 ч и кратко смочите вихрь. Нанесите собранную среду на агаровые планшеты Лурии-Бертани (LB) с использованием метода разведения трека для количественного определения количества бактерий, трансцитозированных в течение первых 2 ч эксперимента.
   ЗАМЕТКА: Извлечение бактерий каждые 30 минут и удержание их на льду сводит к минимуму рост бактерий в сборных лунках, а измерения проводятся преимущественно на трансцитозных бактериях.
4. Поместите маркированные агаровые планшеты LB для разведения дорожки в бактериальный инкубатор при температуре 37 °C без дополнительного CO₂ и верните планшет T84 transwell в инкубатор для тканевых культур.
5. При t = 4 ч повторите шаг 2.3, объединив собранные среды от t = 2,5 ч, t = 3 ч, t = 3,5 ч и t = 4 ч.
6. При t = 6 ч повторите шаг 2.3, объединив собранные среды от t = 4,5 ч, t = 5 ч, t = 5,5 ч и t = 6 ч. Кроме того, при t = 6 ч провести пластинчатую обработку среды из контрольных лунок.

3. Окончание эксперимента

1. Измерьте и запишите трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) в конце эксперимента, t = 6 ч.
2. Обеззараживайте зонд, погрузив его в 70% этанол на 10-15 минут. При желании выбросьте вставки или сохраните/обработайте их для дополнительных применений. Дайте агаровым планшетам LB инкубироваться в течение ночи, а также продезинфицируйте и/или безопасно утилизируйте все другие используемые материалы.
3. После ночной инкубации подсчитайте колонии бактерий вручную на планшетах для разведения LB, чтобы определить количество инокулюма и количество трансцитоза E. coli . Убедитесь, что контрольные пластины не показывают роста бактерий.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
15 мл стерильные конические пробирки	МидСайд	С15В
Пробирки для микроцентрифуг объемом 2 мл	Авангард	AVSS2000
50 мл стерильные полипропиленовые конические пробирки	Сокол	352070
Центрифуга	Сорвалл	Легенда RT
Одноразовые петли для инокуляции	Фишербранд	22363605
Модифицированная среда Dulbecco Eagle (DMEM)	Gibco	11965-084
Эпителиальный вольт/омметр	Мировые прецизионные приборы	ЭВОМ
Шейкер для инкубатора	Нью-Брансуик	Иннова 4080
Инкубаторы	Термо Сайентиал	51030284	В методе используются три из них: один для культивирования стерильных тканей, один для культивирования инфицированных тканей и один для бактериальной инкубации.
Отвар лизогении	Дифко	244610
Лизогенный отвар агар	IBI Scientific	IB49101
Спектрофотометр	Юнико	1100RS
Клетки кишечника T84	Американская коллекция тканевых культур	ССЛ248
Вкладыши для культивирования тканей, с мембраной из полиэтилентрефталата, поры 3 мкм, формат 24 лунки	Сокол	353096
Планшет для культивирования тканей, 24 лунки	Сокол	353504