В этом видео демонстрируется получение генетически модифицированной культуры Borrelia burgdorferi, сконструированной с использованием ДНК спящего бактериофага, несущей ген устойчивости к антибиотикам. После выбора антибиотика и инкубации химический индуктор вызывает повреждение ДНК, что приводит к эксцизии, репликации и сборке новых вирионов, содержащих ген устойчивости. После второго центрифугирования и ресуспензии бактериальные клетки, содержащие зрелые вирусные частицы, готовы к последующему применению.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Приготовление и индукция культур Borrelia burgdorferi для получения вирусных частиц
769 просмотров
⸱
26 сентября 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
1. Подготовка культуры B. burgdorferi к производству φBB-1
- Приготовьте среду Barbour-Stoenner-Kelly с добавлением 6,6% термоинактивированной нормальной сыворотки кролика (BSK). Для 1 л 1x BSK смешайте компоненты, перечисленные в таблице 1 , в 900 мл воды, отрегулируйте pH до 7,6, используя 1 N гидроксид натрия, и медленно перемешайте при 4 °C в течение 2-4 часов. После завершения смешивания проверьте и при необходимости отрегулируйте pH до 7,6, а также увеличьте объем до 1 л воды. Простерилизуйте среду, пропустив через фильтр 0,22 мкМ (см. Таблицу материалов) и используйте в свежем виде или храните при температуре 4 °C в течение ≤2 месяцев.
- За три-пять дней до начала протокола трансдукции инокулируйте 150 мкл соответствующего клона(ов) B. burgdorferi в 15 мл 1x BSK в плотно закрытые стерильные конические центрифужные пробирки (см. Таблицу материалов). Дополните среду соответствующей концентрацией антибиотиков или комбинацией антибиотиков для отбора и поддержания гетерологичной ДНК в клонах B. burgdorferi (Таблица 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: B. burgdorferi является организмом уровня биобезопасности 2. Принимайте все соответствующие меры предосторожности во время работы с этим организмом. Все работы с живыми культурами B. burgdorferi выполнять в сертифицированном и должным образом продезинфицированном шкафу биобезопасности II класса. Надлежащим образом утилизируйте весь материал, контактирующий с B. burgdorferi и самими микроорганизмами, в соответствии с рекомендациями Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC). - Инкубируют культуры при температуре 33 °С, не встряхивая, до тех пор, пока культуры не достигнут плотности ≥5 ×10 7 спирохет·мл−1, что занимает примерно 3-5 дней.
3. Индукция фага B. burgdorferi φBB-1
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте всю стеклянную и пластиковую посуду путем автоклавирования; стерилизуют все растворы путем автоклавирования или фильтрации через фильтр 0,22 мкМ. Приведенные ниже шаги основаны на объемах 15 мл, но метод можно масштабировать на меньшие или большие объемы в зависимости от индивидуальных потребностей эксперимента.
- Для культуры B. burgdorferi , из которой будет получен фаг (донор), используйте концентрацию, рассчитанную любым из методов на шаге 2, чтобы определить объем закваски, необходимый для получения 4 мл 2 × 108 спирохет·мл-1. В результате получается конечная концентрация 5 × 107 спирохетов·мл-1 в 15 мл на стадии восстановления (шаг 3.6 ниже).
- Центрифугируйте объем культуры, рассчитанный на шаге 3.1, при 6000 х г в течение 10 мин. Сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 4 мл свежего BSK. Перенесите образец в самую маленькую стерильную пробирку, доступную для хранения образца с минимальным пространством для напора.
- Добавьте соответствующее количество индуцирующего агента к рекомендуемой концентрации (Таблица 3) из расчета на объем культуры 4 мл, чтобы индуцировать продукцию фагов. Плотно закройте тюбик крышкой и тщательно перемешайте.
- Инкубируйте образец при температуре 33 °C в течение 2-4 часов.
- После инкубации переложите образец в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте образец при давлении 6 000 x g в течение 10 минут. Сцедите надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 15 мл 1x BSK.
Таблица 1: BSK для культивирования и отбора клонов B. burgdorferi для трансдукционных анализов. Описанная здесь рецептура и приготовление 1x BSK для культивирования B. burgdorferi и 1,5x BSK для твердофазной селекции клонов B. burgdorferi основаны на методе Сэмюэля. Различные составы BSK (или MKP), которые поддерживают рост B. burgdorferi, еще не были протестированы с помощью трансдукционного анализа.
| Компонент | 1x BSK (для культивирования) (1 л) | 1,5x BSK (для покрытия) (1 л) |
| Бычий сывороточный альбумин (фракция V) | 35 г | 52,5 г |
| 10x CMRL-1066 (без L-глютамина) | 8 г | 12 г |
| Неопептон | 4 г | 6 г |
| Дрожжеватое | 1,6 г | 2,4 г |
| ХЕПЕС | 4,8 г | 7,2 г |
| Глюкоза | 4 г | 6 г |
| Цитрат натрия | 0,56 г | 0,84 г |
| Пируват натрия | 0,64 г | 0,96 г |
| N-ацетилглюкозамин | 0,32 г | 0,48 г |
| Бикарбонат натрия | 1,76 г | 2,64 г |
| Термоинактивированная нормальная сыворотка кролика (INRS) | 66 мл | 99 мл |
Таблица 2: Потенциальные антибиотики и концентрации, которые могут быть использованы для отбора и поддержания гетерологичной ДНК у B. burgdorferi. Этот список основан на современных маркерах, устойчивых к антибиотикам, обычно используемых у Borrelia burgdorferi. Канамицин, гентамицин и стрептомицин получают в воде, стерилизуют фильтром через фильтр 0,22 мкМ и хранят при -20 °C. Эритромицин получают в 95% этаноле и хранят при -20 °C. Многие лаборатории сообщают об успешном использовании канамицина для селекции в концентрации 200 мкг·мл−1; При использовании гентамицина и канамицина для отбора в трансдукционных анализах используют 400 мкг·мл-1 канамицина. Ген aadA обеспечивает устойчивость как к стрептомицину, так и к спектиномицину. Для подбора конструкций, содержащих ген aadA в E. кишечной палочки, 100 мкг·мл-1 спектиномицина. Обратите внимание, что аминогликозиды (канамицин, гентамицин и стрептомицин) не являются клинически значимыми при лечении болезни Лайма; Тем не менее, эритромицин используется клинически в определенных ситуациях. Несмотря на то, что сообщалось о естественной устойчивости к этому антибиотику у B. burgdorferi , этот маркер резистентности до сих пор не использовался в анализах трансдукции, описанных здесь.
| Антибиотик | Концентрация запасов | Конечная концентрация в культуре Bb |
| Канамицин | 100 mg.mL-1 (в воде) | 200-400 мк g.mL-1 |
| Гентамицин | 50 mg.mL-1 (в воде) | 50 мкм g.mL-1 |
| Стрептомицин | 50 mg.mL-1 (в воде) | 50 мк g.mL-1 |
| Эритромицин | 2 mg.mL-1 (в EtOH) | 0,06 мкм g.mL-1 |
Таблица 3: Потенциальные индуцирующие агенты и концентрации, используемые для индукции φBB-1 из B. burgdorferi. Было продемонстрировано, что N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (MNNG), митомицин C и этанол, а также метанол и изопропанол индуцируют φBB-1 выше конститутивных уровней в штамме B. burgdorferi CA.11-2A. МНГ является подозреваемым канцерогеном и опасностью для окружающей среды; Используйте с осторожностью, растворите в горючем растворителе и сожгите для утилизации. Митомицин С является подозреваемым канцерогеном и потенциальной опасностью для окружающей среды; Используйте с осторожностью под вытяжным шкафом для химикатов и утилизируйте надлежащим образом. В то время как опубликованные данные свидетельствуют о том, что МННГ является наиболее эффективным агентом для индуцирования φBB-1, опасность работы с этим химическим веществом и трудности в его приобретении затрудняют его использование, особенно для студентов. Индукция этанолом всегда лучше, чем метанолом или изопропанолом, и чаще всего используется в трансдукционном анализе.
| Индуцирующий агент | Концентрация исходного материала (растворитель) | Конечная концентрация в образце |
| Этанол | 100% (нет) | 5% |
| Митомицин С | 2 mg.mL-1 (вода) | 20 мк g.mL-1 |
| 1-метил-3-нитрозо-нитрогуанидин (МННГ) | 50 mg.mL-1 (ДМСО) | 10 мкм g.mL-1 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фильтрующие установки 1 л (PES, размер пор 0,22 мкм) | Миллипора Сигма | S2GPU10RE | |
| Трубка 12 мм x 75 мм (двухпозиционная крышка) (полипропилен) | США Сайентифик | 1450-0810 | вмещает 4 мл с малым объемом пустот (для индукции) |
| Конические центрифужные пробирки 15 мл (полипропилен) | США Сайентифик | 5618-8271 | |
| 1-метил-3-нитрозо-нитрогуанидин (МННГ) | Миллипора Сигма | ВНИМАНИЕ: потенциальный канцероген; больше не доступен, не тестировал предложенный заменитель | |
| 5,75-дюймовые пипетки Пастера (с ватной пробкой/боросиликатное стекло/нестерильные) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8А | Автоклав перед использованием |
| Конические центрифужные пробирки 50 мл (полипропилен) | США Сайентифик | 1500-1211 | |
| Абсолютный этанол | |||
| Бакто Неопептон | Gibco | ДФ0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| Бычий сывороточный альбумин (степень замены сыворотки) | Биопродукты Gemini | 700-104П | |
| CMRL-1066 без L-глютамина (порошок) | Биологическая наука США | С5900-01 | Сорт клеточной культуры |
| Эритромицин | Исследовательская международная корпорация «Ресерч продактс интернэшнл» | Э57000-25.0 | |
| Раствор реагента гентамицина | Gibco | 15750-060 | |
| Глюкоза (декстроза безводная) | Thermo Fisher Scientific | БП350-500 | |
| ХЕПЕС | Thermo Fisher Scientific | БП310-500 | |
| Канамицина сульфат | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (размер пор 0,22 μM) | Миллипора Сигма | SLGSM33SS | для фильтрации стерилизующих антибиотиков и других небольших растворов |
| Митомицин С | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | ВНИМАНИЕ: потенциальный канцероген; использовать только в вытяжном шкафу для химикатов |
| N-ацетил-D-глюкозамин | МП Биомедикалс, ООО | 100068 | |
| Чашка Петри (100 мм × 15 мм) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Сыворотка кролика нестерильная следовогемолизированный молодняк (НРС) | Пел-Фриз Биопрепараты | 31119-3 | Отключение нагрева в соответствии с инструкциями производителя |
| Бикарбонат натрия | Thermo Fisher Scientific | БП328-500 | |
| Пируват натрия | Миллипора Сигма | П8674-25Г | |
| Раствор стрептомицина сульфата | Миллипора Сигма | С6501-50Г | |
| Тринатрия цитрата дигидрат | Миллипора Сигма | С1804-500Г | цитрат натрия для BSK |
