Детектирование целевого аналита с помощью бактериального биосенсора

Аннотация

Источник: Barber, A. E., et al. Подготовка и применение нового бактериального биосенсора для предполагаемого обнаружения следов огнестрельного оружия. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется обнаружение конкретных аналитов с помощью бактериального биосенсора. Берется бактериальная культура, несущая плазмиду с геном красного флуоресцентного белка (RFP) под промотором, чувствительным к аналиту. После тщательного протирания тестовой поверхности небольшой участок салфетки погружают в культуру и инкубируют. Взаимодействие аналита с промотором активирует экспрессию RFP, подтверждая наличие целевого аналита.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Представлен синтез E. coli , экспрессирующей красный флуоресцентный белок (RFP).

1. Получение плазмидной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из кишечной палочки

1. Разморозьте E.coli, содержащую плазмиду с геном RFP и геном устойчивости к ампициллину, и выращивайте E.coli на агаровых планшетах Luria Broth (LB), содержащих 100 мкг/мл ампициллина, при 37 °C в течение 24 ч. Например, возьмем плазмиду J10060 из реестра стандартных биологических частей, используемых для синтетической биологии (см. Таблицу материалов). Плазмида J10060 включает в себя ген RFP под контролем промоторной области pBad и ген устойчивости к ампициллину. В качестве альтернативы можно трансформировать E.coli (см. шаг 3.2) с помощью плазмиды до начала роста на пластинах LB-агара.
2. Следуйте стандартному протоколу miniprep (см. Таблицу материалов) для выделения ДНК из 1 мл культуры E. coli , содержащей плазмиду J10060. Цель следующего протокола — удалить промотор pBad и заменить его желаемым промотором для устройства.
3. После мини-подготовки плазмиды храните ДНК в морозильной камере до готовности к перевариванию.

2. Переваривание ферментов

1. В микроцентрифужной пробирке для разложения EcoRI и NheI необходимо провести следующую реакцию: 10 мкл плазмидной ДНК J10060 (выделено на этапе 1), 8 мкл воды и по 1 мкл ферментов EcoRI и NheI, предварительно смешанных с 1 мкл буфера (см. Таблицу материалов).
2. Для промоторной ДНК в микроцентрифужной пробирке для расщепления EcoRI и NheI проводят следующую реакцию: 10 мкл отожженных последовательностей промоторной ДНК (8 мкл воды и по 1 мкл ферментов EcoRI и NheI, предварительно смешанных с 1 мкл буфера.
   1. Для сурьмы (Sb-), свинца (Pb-) или тринитротолуола (TNT)-RFP (см. Таблицу материалов) растворите олигонуклеотиды в буфере (30 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновая кислота (HEPES), pH 7,5; 100 мМ ацетата калия), инкубируйте в равных молярных концентрациях, нагревайте до 94 °C в течение 2 мин и постепенно охлаждайте при комнатной температуре).
3. Перемешайте образцы, аккуратно пипетируя вверх и вниз с помощью пипетки, установленной на 10 μл.
4. Выдерживать в течение 30 минут при температуре 37 °C.
5. Нагрейте ферменты при температуре 80 °C в течение 5 минут.
6. Храните переваренную ДНК в морозильной камере до тех пор, пока она не будет готова к следующему этапу.

3. Лигирование и трансформация

1. Лигатура
   1. Используя плазмиду и промоторную ДНК, которые были дважды расщеплены с помощью EcoRI и NheI на стадии 2, настроили реакционную смесь, показанную в таблице 1 , в микроцентрифужной пробирке на льду; добавьте T4 DNA Ligase в последнюю очередь. ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 показано лигирование с использованием молярного вектора 1:3 для вставки для указанных размеров ДНК.
   2. Осторожно перемешайте реакцию с помощью пипетирования вверх и вниз и кратко произведите микроцентрифугу.
   3. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут.
   4. Нагрейте при температуре 65 °C в течение 10 минут.
2. Преобразование
   1. Разморозьте пробирку с 20 мкл DH5-альфа Компетентных клеток E. coli на льду до тех пор, пока не исчезнут последние кристаллы льда.
   2. Добавьте в клеточную смесь 5 мкл плазмидной ДНК. Осторожно переверните пробирку 4-5 раз, чтобы смешать клетки и ДНК.
   3. Выложите смесь на лед на 2 минуты.
   4. Тепловой шок при температуре ровно 42 °C ровно на 30 с. Не перемешивайте.
   5. Выложите на лед на 2 минуты. Не перемешивайте.
   6. Пипеткой введите в смесь 380 мкл супероптимального бульона комнатной температуры с подавлением катаболитов (SOC). Немедленно распределите на агаровую пластину LB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл) и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
   7. Проверьте пластины в течение 24 часов на рост.
   8. Заклейте пластины герметизирующей пленкой и храните их в холодильнике до готовности к следующему этапу.

4. Колоний-полимеразная цепная реакция (ПЦР)

1. Добавьте в пробирку для ПЦР (установите 4 реакционные пробирки) реакционные смеси, показанные в таблице 2.
2. Аккуратно перемешайте реакции, пипетируя вверх и вниз.
3. С помощью желтого наконечника пипетки соскребите колонию (или очень маленькую область) трансформированной кишечной палочки. Перенесите каплю этой кишечной палочки на новую отрезанную пластину LB/ампициллин/агар, а затем вставьте наконечник пипетки в ПЦР-пробирку. Встряхните наконечник пипетки, чтобы смешать кишечную палочку со смесью для ПЦР. Повторите еще три раза для дополнительных колоний. Перенесите пробирки для ПЦР в аппарат для ПЦР и начните термоциклирование с помощью программы, показанной в таблице 3.
4. Проведите гель-электрофорез с использованием 2% агарозного геля в TAE 9Tris-Acetate-EDTA), чтобы определить, какие колонии имеют наилучшее лигирование в плазмиду, и вырастите эти колонии на новой пластине.
5. Храните тарелки в холодильнике до тех пор, пока они не будут готовы к тестированию. Приготовьте жидкую культуру в бульоне Лурия с добавлением ампициллина 100 мкг/мл для химического испытания.

5. Секвенирование ДНК

1. Для каждого образца добавьте 5 мкл плазмиды, 4 мкл праймера для секвенирования и 3 мкл деионизированной воды.
2. Поместите эту смесь в пробирку и отправьте ее на секвенирование ДНК (см. Таблицу материалов).
3. Анализируйте данные последовательностей ДНК для сравнения ожидаемых и наблюдаемых последовательностей ДНК с помощью программного обеспечения для анализа последовательностей ДНК, чтобы убедиться в отсутствии мутаций и правильном введении генов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование E. coli в качестве химического сенсора представлено ниже.

6. Подготовка культур кишечной палочки

1. Приготовьте LB со 100 мкг/мл ампициллина для жидких культур.
2. Приготовьте жидкие культуры сенсорных бактерий, бактерий положительного контроля** и бактерий отрицательного контроля**.
   ПРИМЕЧАНИЕ: *Положительные контрольные бактерии: E. coli , содержащая плазмиду с геном RFP под контролем конститутивного промотора; В данной работе использовалась плазмида E1010 из реестра стандартных биологических частей, используемых в синтетической биологии (см. Таблицу материалов).** Бактерии отрицательного контроля: E. coli , содержащая плазмиду с геном RFP под контролем другого промотора, такого как промотор pBad (плазмида J10060 из реестра стандартных биологических частей, используемых для синтетической биологии (см. Таблицу материалов) или плазмида, не имеющая гена RFP.
3. Поместите культуры в встряхивающий инкубатор при температуре 37 °C и 220 об/мин на срок от 8 до 18 часов. Мутный отвар свидетельствует о росте бактерий.

7. Титрование E. coli для проверки работы прибора

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как датчики были титрованы для проверки работоспособности, этот шаг не нужно повторять. Положительный контроль в виде добавления свинца, сурьмы и 2,4-DNT или 1,3-динитробензола (1,3-DNB) позволяет проверить работу устройств для каждого использования без необходимости полного титрования.

1. Приготовьте исходный раствор исследуемого аналита (анализов) в концентрации 10 ppm в воде. Если растворимость является проблемой, используйте смесь воды и метанола 50/50.
2. Используя таблицу 4 в качестве руководства, пометьте соответствующее количество стерильных пробирок для культивирования и поместите 2 мл культивированного бульона (из протокола шага 6) в каждую пробирку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить общий аналитический диапазон, проведите по крайней мере три различных уровня аналита с сенсорными бактериями, один уровень с отрицательным контролем и один уровень с положительным контролем. Также должна быть по одной пробирке каждой из бактерий, в которую не добавлен металл (еще один тип отрицательного контроля). Для более точного определения аналитического диапазона и пределов обнаружения используйте более широкий диапазон концентраций аналита.
3. Добавьте исходный раствор аналита в пробирки, содержащие 2 мл бульона, как указано в таблице 4, поместите защелкивающиеся колпачки на пробирку для культивирования так, чтобы они были ослаблены (чтобы обеспечить приток воздуха внутрь пробирки), и закрутите пробирку для культивирования.
4. Неплотно оставьте защелкивающиеся крышки на пробирках для культивирования и поместите их в встряхивающий инкубатор при 220 об/мин и 37 °C не менее чем на 24 часа.
5. Извлеките пробирки из инкубатора, плотно защелкните крышки на пробирках и храните пробирки в холодильнике до тех пор, пока они не будут готовы к флуоресцентному анализу.

8. Использование кишечной палочки в качестве химического датчика остатков огнестрельного оружия (GSR)

1. С помощью салфетки на основе этанола, предназначенной для удаления свинца (см. Таблицу материалов), протрите все поверхности рук, в том числе между пальцами. Используйте отдельную салфетку для каждой руки. Храните салфетки в герметичном пакете с соответствующей маркировкой до анализа.
2. Для проверки поверхностей используйте салфетку на спиртовой основе для больших поверхностей или ватный тампон, смоченный этанолом, для небольших поверхностей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы продемонстрировать реакцию датчиков на GSR, внутренняя часть стреляной гильзы калибра .40 была промакнута ватным тампоном, смоченным в этаноле.
3. Надев чистые перчатки и используя ножницы, протертые спиртом, отрежьте примерно 1 см² секции от центра салфетки.
4. Поместите отрезанный кусок салфетки для рук или ватного тампона непосредственно в пробирку для культивирования, содержащую 2 мл сенсорных бактерий, убедившись, что она погружена в бульон.
5. Действуйте, как описано выше, в шагах 7.4 – 7.5.

Таблица 1. Реакционная смесь для лигирования, протокол шаг 3.1.1.

КОМПОНЕНТ	РЕАКЦИЯ 20 μЛ
10X Буфер ДНК-лигазы T4	2 мкл
Плазмидная ДНК (3 kb)	3 мкл
ДНК промотора (0.7kb)	10 μл
Вода без нуклеаз	4 мкл
Т4 ДНК-лигаза	1 μл

 

 

 

 

 

 

Таблица 2. Реакционные смеси для ПЦР колоний, шаг протокола 4.1.

Компонент	Реакция 25 мкл
10 мкМ Прямой Праймер	0,5 мкл
10 μМ Обратный праймер	0,5 мкл
ОдинTaq 2X мастер-микс	12,5 мкл
Вода без нуклеаз	11 μл

 

 

 

 

 

Таблица 3. Термоциклические параметры ПЦР для этапа протокола 4.3.

ШАГ	ТЕМП	ВРЕМЯ
Первичная денатурация	94 °C	30 с
30 циклов	94 °C	30 с
	55 °C	45 с
	68 °С	60 с
Окончательное продление	68 °С	5 мин
Держать	4 °C

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 4. Общая установка эксперимента по титрованию биосенсоров, шаг протокола 7.2.

Идентификатор трубки	Бактерии	Концентрация добавляемого раствора аналита (ppm)	Добавлен металл	Объем раствора аналита добавляется в бульон объемом 2 000 мкл	[аналит], ppb
1	PbRFP	10	Пб	2.5	12
2	PbRFP	10	Пб	75	361
3	PbRFP	10	Пб	150	698
4	PbRFP	0	никакой	0	0
5	RFP neg	10	Пб	10	50
6	RFP pos	10	Пб	10	50

Материалы