Роевой анализ для визуализации подвижности бактериальной поверхности

Аннотация

Источник: Моралес-Сото, Н. и др., Подготовка, визуализация и количественная оценка анализов подвижности поверхности бактерий. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео показан роевой анализ с использованием бактерий, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, для наблюдения за подвижностью поверхности мягкого агара. Покадровая съемка фиксирует скоординированное расширение и образование усиков, подчеркивая подвижность поверхности бактерий.

Протокол

1. Подготовка и инокуляция пробирных сред роевого анализа

1. Подготовка СМИ
   ЗАМЕТКА: Описанный ниже состав среды применим к исследованиям формирования усиков Pseudomonas aeruginosa. Пожалуйста, ознакомьтесь со спецификациями сред в таблице 1 для анализов поверхностной подвижности Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis и Myxococcus xanthus .
   1. Смешайте 200 мл псевдоожиженной аэробной биореакторной среды (FAB) минус сульфат аммония ((NH4)₂SO₄) (Таблица материалов), 0,9 г благородного агара и 0,2 г казаминокислот (Таблица 1), перемешивая с помощью магнитной мешалки. Используйте небольшие объемы (100-300 мл) для улучшения согласованности между экспериментами.
   2. Автоклавируйте смесь агар/среда объемом 200 мл с использованием времени выдержки 22 минуты, температуры воздействия 121,1 °C и опции быстрой вентиляции. Настройки автоклава позволят правильно стерилизовать и плавить агар, но предотвратят карамелизацию агара.
      ЗАМЕТКА: Благородный агар склонен к карамелизации; На карамелизированном агаре изменяется бактериальная подвижность.
   3. Сразу после завершения цикла стерилизации закройте крышку бутылки со средой, чтобы предотвратить потерю воды в результате испарения. Однако обратите внимание, что плотная укупорка может вызвать эффект «вакуумной герметизации» на бутылке.
   4. Охладите среду до 50 °C при помешивании при комнатной температуре (RT) и добавьте 2 мл стерильной глюкозы 1,2 М. В качестве альтернативы поместите среду в инкубатор или водяную баню при температуре 60 °C до готовности к использованию (до 15 часов спустя) и действуйте в соответствии с указаниями. Чтобы предотвратить образование пузырьков в среде, тщательно перемешайте с помощью магнитной мешалки; Пузырьки на поверхности агара предотвратят равномерное роение.
      ЗАМЕТКА: Для других анализов добавляйте термочувствительные компоненты, которые не могут быть автоклавированы, такие как дополнительные питательные вещества или красители, на этом этапе, по мере необходимости (например, 8 мкл красителя Invitrogen Syto 63 на 100 мл расплавленного агара для изображения M. xanthus, как показано в разделе «Репрезентативные результаты» ниже). Добавление некоторых красителей может повлиять на исходное поведение роения, которое следует проверить в сравнении с контролем без красителей.
   5. В лабораторную вытяжку наносят 7,5 мл стерильной среды на чашку Петри из полистирола диаметром 60 мм и выдерживают пластины в один слой (не укладывают). Для большей поверхности роения используйте 25 мл среды на чашку Петри диаметром 100 мм. Важно наполнять посуду ровной горизонтальной поверхностью. Используйте уровень «бычий глаз», чтобы проверить, выровнена ли поверхность.
      ЗАМЕТКА: Для анализов P. aeruginosa использование определенного объема среды на планшет улучшит стабильность и воспроизводимость. Для анализов B. subtilis и M. xanthus ручная заливка дает результаты, сопоставимые с удельными объемными аликвотами.
2. Отверждение пластин
   1. Для небольших пластин (60 мм) дайте расплавленной агаровой среде затвердеть (как в полутвердом состоянии, так и в сухом виде излишков жидкости) в вытяжке без крышки в течение 30 минут. Большие пластины (100 мм) требуют более длительного времени отверждения (см. Обсуждение).
      ЗАМЕТКА: В качестве альтернативы, для некоторых анализов могут потребоваться планшеты для отверждения на столе в течение ночи (20-24 часа), накрытые (т.е. с крышками) в один слой (Таблица 1). Роение чувствительно как к избытку, так и к недостаточному увлажнению. Влажность, воздушный поток и температура в любой конкретной лаборатории могут потребовать изменения в отверждении планшетов, чтобы способствовать оптимальному роению вашей бактерии.
   2. Прививайте пластины сразу после окончания периода сушки. Не храните пластины для дальнейшего использования.
      1. Проведите «тест на растекание чернил», обнаружив на тестовой пластине смесь объемом 10 μл, содержащей 0,50% (об/об.) водостойких черных индийских чернил Хиггинса и бактериального инокулюма. Если смесь чернил и инокулюма легко растекается (т.е. не сохраняет форму капель) на поверхности носителя, носителю потребуется дополнительное время для высыхания.
         ЗАМЕТКА: Для видов, которые особенно чувствительны к влажности (например, P. aeruginosa), проведите быстрый «тест на растекание чернил», чтобы определить, достаточно ли сухие пластины.
3. Посевной анализ роем
   1. Инокулируйте 6 мл питательной среды бульона (подробнее см. Таблицу 1 ) в изолированную колонию из свежей (< 5-дневной давности, если оставить при комнатной температуре) культуры в бульоне лизогенеи (LB). Бульонные культуры инкубировать в течение ночи (≤18 ч) при температуре 30 °C или 37 °C с горизонтальным встряхиванием (240 об/мин).
   2. Инокулируйте роевые пластины путем пятнистости 1-5 мкл ночного бульона или «протыкания» агара стерильной зубочисткой или иглой для инокуляции проволокой.
      ЗАМЕТКА: Мы предпочитаем последний метод, потому что он снижает вероятность разбрызгивания инокулята и предотвращает добавление дополнительной влаги на поверхность роя.
4. Инкубация роевого анализа
   1. Для общего анализа инкубируйте роевые аналитические планшеты при 30 °C или 37 °C (или даже 42 °C для B. subtilis; Таблица 1) — это специфично для бактерий. Во время инкубации переворачивайте пластины так, чтобы лишняя влага конденсировалась на крышке, а не на агаре.
      ЗАМЕТКА: Температура может влиять на фенотип и кинетику. Для роев P. aeruginosa инкубация при 37 °C приводит к более быстрому росту и расширению роя, чем инкубация при 30 °C; Однако морфология этих роев часто отличается в зависимости от изменения температуры.
   2. Для покадровой визуализации инкубируйте роевые планшеты при соответствующей температуре, прежде чем передавать их на станцию визуализации (подробнее см. Таблицу 1 ).
      ЗАМЕТКА: Эта инкубация перед визуализацией позволяет роям начать свое развитие и укорениться, прежде чем они будут перемещены в новую среду, которая может быть или не быть оптимальной для подвижности роя.

2. Макроскопическая визуализация анализов подвижности поверхности

1. Для покадровой визуализации, после инкубационного периода перед визуализацией, поместите пластины роевого анализа на прозрачную рентгенографическую пластину внутри коммерческой станции визуализации in vivo . Изображение до шести пластин диаметром 60 мм или четырех пластин диаметром 100 мм за один раз. Поскольку камера захватывает изображения из-под плоскости изображения, переверните пластины, чтобы оптический путь не был заблокирован. В качестве альтернативы инкубируйте при температуре 30 °C или 37 °C (Таблица 1) в течение всего эксперимента и извлекайте из инкубатора планшеты для визуализации через определенные промежутки времени.
2. Поместите крышки чашек Петри вертикально на пластину, которая удерживает инокулированную среду. Наполните крышки чашек Петри водой, чтобы предотвратить чрезмерное высыхание во время визуализации, и оберните всю установку еще одним прозрачным подносом для поддержания влажности на протяжении всего эксперимента.
3. Используя программное обеспечение для молекулярной визуализации (ИМ), проведите анализ при комнатной температуре с настройками визуализации, описанными в таблице 2. Для покадровой съемки настройте протокол с необходимыми шагами и спецификациями.

Таблица 1: Технические требования к подготовке для анализа подвижности поверхности. Включает в себя требования к подготовке анализа поверхностной подвижности для P. aeruginosa, B. subtilis и M. xanthus.

	P. aeruginosa	Исследования формирования усиков P. aeruginosa	В. subtilis	М. xanthus
Ночная среда для приготовления бульона	FAB плюс 30 мМ глюкозы	FAB плюс 30 мМ глюкозы	ФУНТ	СТТ (комплексные носители)
Температура инкубации бульонной культуры на ночь	37 °C	37 °C	37 °C	30 ч при 30 °C
Роевые медиа	ПОТРЯСАЮЩИЙ	FAB минус (NH4)2ТАК4	2% (масс./об.) LB	КТТ
Роевые среды: дополнительные компоненты	12 мМглюкозы а	10% (масс./об.) казаминокислот (ПКК), 12 мМглюкозы а	н/д	SYTO® 64а
Тип агара	Агар, Благородный	Агар, Благородный	Агар гранулированный	Агар, Благородная Аффиметрикс
Концентрация агара (масс./об.)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
Размер роевой пластины	60 мм	60 мм	100 мм	150 мм
Объем носителя на пластину	7,5 мл	7,5 мл	Ручная заливка	Ручная заливка
Настройка роевого носителя/метод сушки	Капюшон; Непокрытые пластины	Капюшон; Непокрытые пластины	Настольные плиты с крышкой	Настольные плиты с крышкой
Настройка роевого носителя/время сушки	30 мин	30 мин	Ночлег (20 -24 часа)	Ночлег (20 -24 часа)
Температура инкубации роевого анализа	30 или 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
Инкубация для покадровой съемки	30 °C в течение не менее 4 часов	30 °C в течение не менее 4 часов	37 °C в течение 2 часов	RT за 12 часов
Продолжительность цейтраферной съемки	24 ч	24 ч	10 ч	66 ч
Настройка интервальной съемки	1 кадр/10 мин	1 кадр/10 мин	1 кадр/6 мин	1 кадр/10 мин
a Добавлено после автоклавирования.

 

Таблица 2: Спецификация визуализации. Технические характеристики станции визуализации Bruker для красной и зеленой флуоресцентной и люминесцентной визуализации роста поверхности бактерий.

Сигнал	Зеленая флуоресценция	Красная флуоресценция I	Красная флуоресценция II	Люминесценция
Белок или краситель	Зеленый флуоресцентный белок (GFP)	Вишневый протеин или краситель рамнолипидов нильского красного цвета	SYTO® 64	Люцифераза из оперона люкс
Длина волны возбуждения (нм)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	От
Длина волны излучения (нм)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	Без фильтра
Время экспозиции (сек)	30	60	60	240
Ф-ступень	4.0	4.0	2.5	1.1
Поле зрения (мм)	190	190	140	120
Фокальная плоскость (мм)	27.5	27.5	12.2	4
Биннинг (пиксели)	Никакой	2 х 2	Никакой	8 х 8

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагенты:
FAB минимальные носители:				Готовьте каждые ~4 недели. Долейте до 1 л с наночистым H2O.
(NH4)2СО4	Сигма	А4418	2 г	Не используется в исследованиях формирования усиков P. aeruginosa .
Na2HPO4 x 7H2O	Сигма-Олдрич	С9390	9 г
КХ2ГО4	Сигма	П5655	3 г
NaCl	BDH	BDH8014	3 г
MgCl2 x 6H2O раствор (198 г/л)	Научный центр Фишера	М33	1 мл
CaCl2 x 2H2O раствор (14 г/л)	Научный центр Фишера	С79	1 мл
Раствор микропримесей металлов (см. ниже)	н/д	н/д	1 мл
Раствор для микропримесей металлов:				Доверху до 1 л с nanopure H2O. Выдержать в стеклянной бутылке, помешивая и накрыв фольгой.
CaSO4 x 2H2O	Сигма-Олдрич	255548	200 мг
MnSO4 x B2O	Сигма-Олдрич	М7634	20 мг
CuSO4 x 5H2O	Научный центр Фишера	С493	20 мг
ZnSO4 x 7H2O	Сигма-Олдрич	Телефон Z4750	20 мг
CoSO4 x 7H2O	Сигма-Олдрич	С6768	10 мг
NaMoO4 x 2H2O	Сигма	С6646	10 мг
Н3БО3	Научный центр Фишера	А74	5 мг
FeSO4 x 7H2O	Сигма-Олдрич	Ф7002	200 мг
СМИ ЦТТ:				Подготовьте по мере необходимости. Сверху до 100 мл с nanopure H2O.
Tris-HCl, 1 М раствор (довести до pH 8,0)	Амреско	234	1 мл	Приготовьте 1 М стоковый раствор в наночистом H2O. Отрегулируйте pH до 8,0 и простерилизуйте фильтром (поры 0,2 мкм).
K2HPO4, 1 М раствор (отрегулировать до pH 7,6)	Сигма-Олдрич	П3786	0,1 мл	Приготовьте 1 М стоковый раствор в наночистом H2O. Отрегулируйте pH до 7,6 и простерилизуйте фильтром (поры 0,2 мкм).
Раствор MgSO4	Научный центр Фишера	М65	0,8 мл	Приготовьте 1 М стоковый раствор в наночистом H2O. Простерилизуйте фильтр (поры 0,2 мкм).
Казитон	Диагностика BD	225930	1 г
Дополнительные реагенты:
LB Бульон, Леннокс	Диагностика BD	240230	2 % (масса/об.)
D-(+)-глюкоза	Сигма-Олдрич	Г5767	30 мМ для ночных бульонных культур; 12 мМ для роевых сред	Приготовьте стерилизованный исходный раствор фильтра 1,2 М в наночистом H2O. Добавьте в фильтрующий материал после автоклавирования.
Казаминокислоты (CAA)	Амреско	Дж851	0,10 % (масса/об.)	Рекомендуется для исследований формирования усиков P. aeruginosa . Добавьте в среду перед автоклавированием.
Агар, Благородный	Сигма-Олдрич	А5431	0,45 % (масса/об.)	Предпочтительный благородный агар для исследований поверхностной подвижности P. aeruginosa . Добавьте в среду перед автоклавированием.
Агар, Благородный	Аффиметрикс	10907	1,50 % (масса/об.)	Используется в исследованиях поверхностной подвижности M. xanthus . Не рекомендуется для исследований моторики P. aeruginosa . Добавьте в среду перед автоклавированием.
Агар, гранулированный	Научный центр Фишера	БП1423	0,60 % (масса/об.)
Водостойкие черные индийские чернила Хиггинса	Хиггинс	HIG44201	0,50 % (об./об.)	Смешайте чернила с инокулянтом, чтобы проверить влажность поверхности роевого носителя.
SYTO® 64 краситель для флуоресцентных нуклеиновых кислот	Инвитроген	С-11346		Используйте 4 мкл (для P. aeruginosa) или 8 мкл (для M. xanthus) SYTO® 64 на 100 мл расплавленного агара (добавленного после автоклавирования).
Соответствующие материалы и оборудование:
Чашка Петри, стерильная, 150 мм x 15 мм (Dia.x H)	ВВР	25384-326
Чашка Петри, стерильная, 100 мм x 15 мм (Dia.x H)	ВВР	25384-342
Чашка Петри, стерильная, 60 мм x 15 мм (Dia.x H)	ВВР	25384-092
In-Vivo Xtream	Брукер			Использование для макроскопической визуализации исследований подвижности поверхности. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html