Фазово-контрастная микроскопия для оценки мутантов развития у Streptomyces

Abstract

Источник: Bennett, J. A. et al. Визуальная и микроскопическая оценка мутантов развития Streptomyces . J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется использование фазово-контрастной микроскопии для изучения фенотипических различий между Streptomyces coelicolor дикого типа и мутантным Streptomyces coelicolor. В нем описаны этапы, связанные с подготовкой и визуализацией воздушных нитей для обнаружения дефектов развития в образовании спор.

Protocol

1. Проведите фазово-контрастную микроскопию

1. Простерилизуйте пинцет, промыв в 70% этаноле, а затем пропустив через пламя горелки Бунзена для испарения этанола. Дайте остыть.
2. Простерилизуйте покровные листы, вымыв их в 70% этаноле и дав им высохнуть в стерильной чашке Петри.
3. Подготовьте покровную подтяжку бактериального роста, который будет исследован.
   1. Возьмите стерильный покровный лист стерильным пинцетом и положите его на агаровую пластину из маннитовой соевой муки (MS), где наблюдается плотный бактериальный рост Streptomyces coelicolor . Осторожно надавите пинцетом на обратную сторону покровного стекла, чтобы обеспечить достаточный перенос бактериальных спор и воздушного мицелия.
4. Возьмите покровное стекло с пластины и поместите его так, чтобы сторона с клеточным материалом была обращена к поверхности предметного стекла микроскопа, с каплей 15 мкл 50% глицерина, приготовленной в воде для монтажа. Уменьшите количество пузырьков воздуха, поместив покровное стекло под углом 45° к предметному стеклу и дав ему упасть на 50% глицерин.
5. (Дополнительный) Запечатайте прозрачным лаком для ногтей для сохранения горки.
6. Выполняйте фазово-контрастную микроскопию через различные промежутки времени в течение жизненного цикла.
   ЗАМЕТКА: Повторная визуализация позволяет провести более полный анализ и выявить задержки в развитии. Независимо повторяйте наблюдения для обеспечения точности и воспроизводимости.
   1. Поместите подготовленное предметное стекло на предметный столик микроскопа и добавьте каплю погружного масла в центр покровного стекла. Поверните 100-кратный фазовый объектив на место и установите револьверную головку конденсатора на правильную настройку фазы. Сфокусируйте изображение с помощью только ручки точной регулировки, когда линза объектива соприкоснется с маслом.
   2. Изучите несколько полей зрения, чтобы различить заметные и последовательные различия между мутантными штаммами и диким типом, такие как способность образовывать споры, размер и форма спор, а также общее количество спор (см. рисунок 1).
      ЗАМЕТКА: Альтернативой фазово-контрастной микроскопии являются дифференциально-интерференционно-контрастная микроскопия (DIC) и простые методы окрашивания для использования в светлопольных микроскопах, такие как кристаллическое фиолетовое окрашивание.

Results

Рисунок 1: Фазово-контрастные микроснимки, показывающие репрезентативную воздушную нить для белых мутантных штаммов Streptomyces coelicolor, содержащих случайные мутации при вставке транспозонов. (

Materials