Создание бинарной культуры сахарибактерий с бактериями-хозяевами

Аннотация

Источник: Collins, A. J., et al., Setting Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity. J . Vis. Exp. (2021)

В этом видео показано создание и поддержание бинарной культуры сахарибактерий и их бактерии-хозяина путем их последовательной совместной инкубации в питательной среде, специфичной для хозяина.

Протокол

1. Концентрат клеток сахарибактерий методом центрифугирования
   1. Сделайте ориентировочную отметку на пробирке и крышке и поместите пробирку в высокоскоростную центрифугу с отметкой на верхней стороне. Гранула, образовавшаяся в результате центрифугирования, обычно незаметна. Маркировка поможет определить, где находится гранула клеток сахарибактерий при проведении центрифугирования и извлечении пробирки из центрифуги.
   2. Центрифугируйте образцы при 60 000 x g в течение 1 ч при 4 °C.
      ЗАМЕТКА: Этой силы и времени достаточно, чтобы гранулировать все клетки сахарибактерий. Тем не менее, клетки сахарибактерий могут быть по меньшей мере частично гранулированы центрифугированием в течение всего 20 мин при 20 000 x g.
   3. Осторожно извлеките пробирки из центрифуги. Вылейте жидкость из трубки, держа гранулу на верхней стороне трубки.
   4. Ресуспендируйте обычно невидимую гранулу в 1-2 мл буфера MRD (Maximal recovery diluent) путем энергичного вихревого движения.

2. Заражайте культуры хозяина фильтратом, обогащенным сахарибактериями

1. Приготовьте пробирки для культивирования, выделив 2 мл подходящей питательной среды (например, TSBY (триптический соевый бульон с 0,1% экстрактом дрожжей), BHI (инфузия сердца мозга) и т. д.) в пробирки.
2. Добавьте в каждую пробирку 200 μл ночной культуры организмов-хозяев. Добавьте в каждую пробирку по 100-200 мкл ресуспендированного, отфильтрованного образца.
3. Инкубируйте комбинированные образцы в соответствии с требованиями организма-хозяина (например, при температуре 37 °C в аэробной атмосфере для Arachnia propionica).
4. Проходите клетки каждые два-три дня, пересаживая 200 мкл бинарной культуры в 2 мл свежей питательной среды в новой пробирке. Если окажется, что прошедшие культуры не демонстрируют роста (т.е. мутность/оптическая плотность культуры не увеличивается после прохождения в свежую среду), сахарибактерии могут подавлять или убивать все организмы-хозяева. Чтобы исправить это, добавьте 200 мкл неинфицированной культуры хозяина при прохождении клеток. Повторите не менее 5 отрывков.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бульон для инфузии сердца (обезвоженный порошок)	Бектон-Дикинсон	211059	Или другие питательные среды, подходящие для целевых организмов
Ротор центрифуги 70-Ti	Бекман Коултер	337922
2 Управление перчаточным ящиком InVitro	Скромные прачечные	31615	При необходимости для микроаэробных организмов
Высокоскоростная центрифуга Optima L-100 XP	Бекман Коултер	8043-30-1124
Микропипетка P-1000	Гилсон	F123601G
Микропипетка P-200	Гилсон	F123602G
PBS (фосфатно-солевой буфер)	Научный центр Фишера	BP399500
Пептон	Научный центр Фишера	БП1420-500
Наконечники для пипеток - 1000 μл	Научный центр Фишера	02-717-166
Наконечники для пипеток - 200 μл	Научный центр Фишера	02-717-165
Конические центрифужные пробирки с винтовой крышкой 15 мл	Сокол	352096	Или другая пробирка подходит для бактериального посева
Толстостенные поликарбонатные пробирки 25 x 89 мм (емкость 26,3 мл) с крышками	Бекман Коултер	355618
Триптические пластины агара с соевой кровью	Северо-восточные лабораторные услуги	П1100	Или другая агаровая пластина, достаточная для роста организмов-хозяев
Триптический соевый бульон (обезвоженный порошок)	Бектон-Дикинсон	211825	Или другие питательные среды, подходящие для целевых организмов
Дрожжевой экстракт	Научный центр Фишера	БП1422-500