Субкультивирование сульфитредуцирующих анаэробных бактерий из культуры агара

Аннотация

Источник: Anwar, Z., et al. Обогащение и обнаружение токсинотипов Clostridium perfringens в образцах розничных продуктов питания. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео сульфитредуцирующие бактерии культивируются в сульфитсодержащей среде агара, где они растут анаэробно и восстанавливают сульфит до сероводорода, образуя черные осадки с ионами железа. Черные колонии выделяют из глубины агара с помощью асептических методов и переносят в свежую среду для продолжения анаэробной инкубации.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Clostridium perfringens считается организмом уровня биологической опасности 2 (BSL2). Хотя не все образцы пищевых продуктов содержат C. perfringens, все культивируемые образцы следует рассматривать как таковые. Все надлежащие меры предосторожности и средства защиты персонала (СИЗ) должны быть постоянно ношены. Обеззаритите весь материал перед утилизацией.

1. Приготовьте модифицированную среду RPM (Rapid perfringens)

1. Смешайте 30 г/л жидкой тиогликолятной среды, 60 г/л желатина, 5 г/л пептона, 5 г/л глюкозы, 5 г/л диосновного калийфосфата, 3 г/л дрожжевого экстракта, 1,5 г/л хлорида натрия, 0,5 г/л сульфата железа в деионизированной воде до равномерного диспергирования. Обычно мы делаем партии объемом 1 л.
2. Автоклав при 121 °C в течение 15 мин.
3. Дайте остыть примерно до 40 °C.
4. Как только обороты остынут, добавьте D-циклосерин до конечной концентрации 440 мг/л.
   ЗАМЕТКА: Исходные концентрации D-циклосерина, растворенного в стерильной воде в концентрации 50 мг/мл, могут храниться при температуре -20 °C для использования в будущем.
5. Асептически передавайте 10 мл RPM в конические пробирки объемом 15 мл. RPM можно готовить партиями и хранить при температуре 4 °C до одного месяца.
6. Перед использованием нагрейте обороты до 37 °C.

2. Отбор образцов и инкубация RPM

1. Транспортируйте продукты питания в лабораторию при температуре окружающей среды в течение 1 часа. Продукты питания могут перевозиться в оригинальной упаковке или стерильных контейнерах. Если продукты не будут проверены сразу, их можно хранить при температуре -20 °C до использования. Если имеется, укажите тип продукта питания и страну происхождения в соответствии с этикеткой упаковки, а также любую другую соответствующую информацию.
2. Удалите примерно 1,0–2,0 г пищи и переложите в стерильную чашку Петри или эквивалент. Мелко пропустить через мясорубку стерильным лезвием бритвы или скальпелем.
3. Инокулируйте в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в коническую пробирку объемом 15 мл. Хорошо перемешайте.
   1. Чтобы выбрать вегетативные клетки, переложите 5 мл пищевой смеси PBS в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл RPM. Плотно закройте крышкой.
   2. Чтобы выбрать споры, нагрейте оставшиеся 5 мл пищевой смеси PBS при 85 °C в течение 15 минут, а затем переложите в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл оборотов. Плотно закройте крышкой.
4. Сделайте вихревые и инвертируйте пищевые культуры RPM, чтобы обеспечить полное перемешивание.
5. Плотно закройте конические трубки и оберните крышки парафиновой пленкой или полиэтиленовой пленкой, чтобы обеспечить анаэробную среду.
6. Инкубировать в течение ночи (ON) при 37 °C.
7. На следующее утро обратите внимание на помутнение или брожение в пробирках RPM.

3. Сэндвич-покрытие TSC (триптозный сульфитный циклосерин)

1. Инокулируйте культуры ON RPM в агар TSC с использованием метода «бутерброда» (рис. 1), описанного ниже.
2. Приготовьте агар TSC в соответствии с инструкциями производителя.
   1. Подготовьте базовый слой пластин TSC, перенеся 10 мл расплавленного агара TSC в стерильные чашки Петри, и дайте им застыть. Их можно заранее приготовить и хранить при температуре 4 °C. Перед использованием убедитесь, что тарелки нагреты до комнатной температуры.
   2. Для верхнего слоя пластины TSC поддерживайте оставшийся расплавленный агар TSC при температуре 40 °C.
      ЗАМЕТКА: Хотя температура плавления агара выше 85 °C, расплавленный агар затвердевает при температуре около 32–45 °C.
3. Осторожно извлеките культуры ON RPM и перенесите 100 мкл на основание агара TSC. Из-за ферментации некоторые культуры могут находиться под давлением. Обязательно наденьте все подходящие СИЗ.
4. Распределите инокулят RPM с помощью стерилизованных стеклянных шариков или разбрасывателя клеток.
5. Дайте RPM «впитаться» в агар TSC в течение 5–10 минут при комнатной температуре.
6. Осторожно перенесите 20 мл расплавленного, 40 °C TSC агара на планшет с помощью серологической пипетки.
7. Установите на место крышку чашки Петри и дайте агару TSC полностью застыть при комнатной температуре.
8. Переверните чашку Петри и инкубируйте при температуре 37 °C.
9. Если требуется серийное разведение, выполняйте разведение культур ON RPM в свежие, предварительно подогретые RPM перед инокуляцией в агар TSC.

4. Субкультивирование сульфитредуцирующих колоний

1. На следующее утро достаньте планшеты из инкубатора и осмотрите их на предмет роста бактерий. Аэробные бактерии могут присутствовать на поверхности агара. Анаэробные бактерии растут внутри агара. Сульфитредуцирующие бактерии окрашивают окружающий агар в черный цвет. Возможные колонии C. perfringens будут черными и внедрены в агар.
2. Предполагаемые колонии C. perfringens будут положительными на восстановление сульфитов и будут казаться черными, встроенными в агар. С помощью стерильной одноразовой пипетки «вырвите» черные колонии из агара и перенесите в 10 мл свежих RPM в коническую пробирку объемом 15 мл. Важно, чтобы воздух из пипетки был удален до прокалывания агара.
3. Если на поверхности планшета наблюдается плотный аэробный бактериальный рост, используйте стерильный скребок для удаления колоний из выбранных областей. Несколько колоний, подозреваемых в C. perfringens, могут быть отобраны из одного и того же планшета TSC в отдельные культуры RPM.
4. Плотно закройте конические крышки трубок и заверните в парафиновую пленку или полиэтиленовую пленку. Инкубировать при температуре 37 °C.

Результаты

Рисунок 1: Схема технологии сэндвича с агаром TSC.

Среда RPM, содержащая бактерии C. perfringens , помещается между двумя слоями агара TSC для создания анаэробной среды.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
D-циклосерин	Сигма-Олдрич	С6880
Глюкоза	Сигма Лайф Сайнс	Д9434-250Г
Одноразовые переводные пипетки	любой бренд		Выберите одну с тонким наконечником, например одноразовые трансферные пипетки Thermo Scientific 137116M/EMD
Наборы для крови и тканей DNeasy	Цягэн	69504	Примечание: были оценены многочисленные наборы для экстракции ДНК и плазмид, этот набор дал наиболее желаемые результаты.
Сухой инкубатор	любой бренд
Флюидная тиогликолатная среда	Ремель	R453452
Желатин из свиной кожи	Сигма Лайф Сайнс	Г1890-500Г
Гептагидрат сульфата железа (II)	Сигма Лайф Сайнс	Ф8633-250 Г
Лизоцим из белка куриного яйца	Сигма-Олдрич	Л6876	Нужен для извлечения ДНК, не входит в комплект
Парапленка или полиэтиленовая пленка	любой бренд
Пептон из казеина и других животных белков	Сигма-Олдрич	70173-100Г
База агара Perfringens (TSC + SFP)	Оксоидный	КМ0587	Изготавливаем агар TSC по инструкции
Калийфосфат двухосновной	Сигма-Олдрич	П2222-100Г
Хлорид натрия	Сигма-Олдрич	С-7653
Скребок для стерильных клеток	любой бренд
Разбрасыватель стерильных клеток	любой бренд
Стерильные чашки Петри	любой бренд
Дрожжевой экстракт	Сигма-Олдрич	70161-100Г