Разделение нуклеотидов (p)ppGpp на основе тонкослойной хроматографии, выделенных из стресс-индуцированных бактерий

Abstract

Источник: Фернандес-Колл, Л. и Кашель, М. Использование радиометки с помощью микротитровой чашки для многократных измерений in vivo Escherichia coli (p)ppGpp с последующей тонкослойной хроматографией. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео представлен высокопроизводительный протокол измерения уровней и динамики нуклеотидов бактериального стресс-реакции ppGpp и pppGpp с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Этот метод обеспечивает мощный, быстрый и экономически эффективный подход к количественному определению (p)ppGpp в бактериальных культурах в различных стрессовых условиях, что позволяет проводить анализ физиологии бактерий с высоким разрешением и строгой реакцией.

Protocol

1. Тонкослойная хроматография
   1. Мягким карандашом отметьте исходную линию на расстоянии 1 см от края пластины для тонкослойной хроматографии (ТСХ) размером 20 см x 20 см из полиэтиленимелимина-целлюлозы (ПЭИ-целлюлозы), которая была удалена ножницами на 5 см сверху. Нанесите 5 μL в виде капли на поверхность PEI для каждого образца. Начните восходящее развитие, не давая этому пятну высохнуть, что улучшает разрешение за счет минимизации разводов.
   2. Восходящее проявление в резервуаре со слоем 1,5 М КН₂ПО₄ (рН 3,4) раствор делают достаточно мелким, чтобы жидкость не касалась места происхождения пробы. Накройте бак герметичным уплотнителем и дайте жидкости подняться до верха обрезанного листа, на 15 см. Для достижения pH 3,4 для раствора 1,5 M KH₂PO₄ необходимо скорректировать pH путем добавления H₃PO₄.
   3. Удалите полностью проявленную хроматограмму и высушите на воздухе при комнатной температуре.
   4. Разрежьте и выбросьте верхнюю часть хроматограммы, содержащую свободный ³²P, в радиоактивные отходы. Эта часть представлена желтым цветом на рисунке 1 и легко визуализируется в ультрафиолетовом свете. При измерении только нуклеотидов (p)ppGpp, которые мигрируют медленнее, чем гуанозинтрифосфат (ГТФ), рекомендуется использовать УФ-видимый стандарт ГТФ, а затем вырезать и отбросить большую верхнюю часть (все, что выше ГТФ, как показано на рисунке 1).
   5. Экспонируйте авторадиографические пленки на ночь с помощью люминофорного экрана.
   6. Проявите пленку. Захват и количественное определение сигнала люминофорного экрана с помощью фосфоимиджера.
       
2. Количественное определение (p)ppGpp
   1. Количественное определение радиоактивных пятен с помощью изображения J.
      ЗАМЕТКА: Количество (p)ppGpp может быть нормализовано до общего количества нуклеотидов G, наблюдаемого в каждом образце (рис. 1). Если объем фона однороден, можно вычесть один пробел (поле 4 на рисунке 1) для коррекции фона. Total G — это сумма обнаруженных GTP + ppGpp + pppGpp. Эта нормализация предполагает, что уровни гуанозинмонофосфата (GMP) и гуанозиндифосфата (GDP) пренебрежимо малы, что справедливо для Escherichia coli. Отношение данного нуклеотида к общему G обеспечивает важный способ коррекции изменений в объеме применяемого образца.

Results

Рисунок 1: Репрезентативный анализ TLC. Схематическое изображение результатов, полученных после авторадиографии и люминофорного скрининга в течение ночи с помощью ТСХ. Пятна, которые необходимо измерить, показаны красным цветом. Так...

Materials