Одноклеточная культура бактерий в гигантских везикулах

Аннотация

Источник: Morita, M., et al. Бактериальная клеточная культура на уровне одной клетки внутри гигантских везикул. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется метод культивирования и наблюдения за отдельными бактериальными клетками, инкапсулированными в гигантские везикулы, закрепленные на поддерживаемом липидном бислое. Система обеспечивает стабильную, долгосрочную визуализацию динамики роста одиночных клеток в ограниченной, физиологически значимой микросреде.

Протокол

1. Подготовка системы наблюдения за гигантскими везикулами (GV) (Bacterial Cell Culture System)

1. Подготовка малых везикул (СВ) для создания опорной двухслойной мембраны
   1. Налейте в стеклянную пробирку 20 мкл раствора POPC (1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина) и 4 мкл раствора биотин-PEG-DSPE (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[биотинил(полиэтиленгликоль)-2000).
   2. Испарите органический растворитель потоком воздуха с образованием липидной пленки и поместите этот образец в эксикатор на 1 ч для полного испарения органического растворителя.
   3. Добавьте в стеклянный флакон 200 мкл 200 мл глюкозы в среде 1x LB (бульон Лурия-Бертани) (наружный водный раствор GV).
   4. Оберните открывающуюся часть стеклянного флакона пленкой и обработайте ее ультразвуком в ультразвуковой ванне (120 Вт) не менее 1 ч.
   5. Готовят СВs методом экструзии с помощью мини-экструдера и поликарбонатной мембраны с размером пор 100 нм.
2. Подготовка камеры ручной работы
   1. Просверлите отверстие диаметром 7 мм полым перфоратором на двустороннем уплотнении (10 мм х 10 мм х 1 мм).
   2. Наклеить двусторонний пломба с отверстием на покровное стекло (30 мм х 40 мм, толщина 0,25–0,35 мм).
3. Подготовка поддерживаемой двухслойной мембраны на покровном стекле в отверстии камеры
   1. Добавьте 30 мкл раствора SV в отверстие камеры (приготовлено в разделе 2.2) и инкубируйте при RT в течение 30 минут.
   2. Осторожно промойте отверстие дважды 20 мкл 1x LB среды, содержащей 200 мМ глюкозы (наружный водный раствор GV) с помощью пипетирования.
4. Иммобилизация ГВ на опорной двухслойной мембране на покровном стекле в отверстии камеры
   1. Ввести в отверстие 10 мкл нейтравидина с наружным водным раствором GV (1 мг/мл) и инкубировать при ОТ в течение 15 мин.
   2. Осторожно промойте отверстие дважды 20 мкл 1x LB среды, содержащей 200 мМ глюкозы (наружный водный раствор GV) с помощью пипетирования.
   3. Добавьте весь раствор, содержащий GV, в отверстие камеры и запечатайте покровным стеклом (18 мм x 18 мм, толщина 0,13–0,17 мм) (рис. 1b).
5. Микроскопическое наблюдение за ростом бактериальных клеток внутри GV
   1. Установите микроскопическую систему нагревательного столика с инвертированным микроскопом, оснащенным объективом с числовой апертурой 40x/0,6 и большим рабочим расстоянием (рис. 1b).
   2. Поместите камеру на микроскопическую систему нагревательного столика (Рисунок 1b). Инкубировать GV, содержащие бактериальные клетки, в камере в статических условиях в течение 6 ч при 37 °C.
   3. Захватывайте и записывайте микроскопические изображения роста бактериальных клеток внутри GV каждые 30 минут с помощью научной камеры на основе комплементарного полупроводника оксида металла (sCMOS).

Результаты

Рисунок 1: Система наблюдения за культурой бактериальных клеток внутри GV. (a) ГВ иммобилизуются на опорной мембране путем связывания биотин-нейтравидина на покровном стекле. GV инкубируются с помощью системы отопления.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бактотриптон	BD Biosciences	211705
Хлороформ	Вако Пьюр Кемикалс	032-21921
Покровное стекло (18 × 18 мм)	Matsunami Glass Ind.	C018181	толщина 0,13–0,17 мм
Защитное стекло (30 × 40 мм)	Matsunami Glass Ind.	под заказ	толщина 0,25–0,35 мм
Настольная центрифуга	Компания «Хай-Тек»	АТТ101	Тип поворотного ротора
Двустороннее уплотнение (10 × 10 × 1 мм)	Нитомс	Т4613
Глюкоза	Вако Пьюр Кемикалс	049-31165
Инвертированный микроскоп	Олимп	IX-73
Метанол	Вако Пьюр Кемикалс	133-16771
Система микроскопических нагревательных столиков	ТОКАЙ ХИТ	ТП-110Р-100
Нефтепродукт	Накалай Теске	23334-85
Нейтравидин	Thermo Fisher Scientific	31000
Объектив	Олимп	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Поликарбонатные мембраны	Avanti Polar Lipids	610005
Камера sCMOS	Андор	Zyla 4.2 плюс	Размер пор 100 нм
Хлорид натрия	Вако Пьюр Кемикалс	191-01665
Сахароза	Вако Пьюр Кемикалс	196-00015
Ультразвуковая ванна	КАК ЕДИНОЕ ЦЕЛОЕ	АСУ-3Д
Дрожжевой экстракт	BD Biosciences	212750
Пластиковая трубка с крышкой 0,6 мл	Уотсон	130-806С
Пластиковая трубка с крышкой объемом 1,5 мл	Сумитомо Бакелит, Ко.	МС4265-М
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоколин	Avanti Polar Lipids	850457П
1,2-дистеароил-снглицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[биотинил(полиэтиленгликоль)-2000]	Avanti Polar Lipids	880129П	ПОПК
			Биотин-ПЭГ-ДСПЭ