Исследование бактериальной реакции на этилен с использованием этилен-высвобождающего соединения

Аннотация

Источник: Augimeri, R. V. et al., Использование этилен-рилизинг-соединения, 2-хлорэтилфосфоновой кислоты, в качестве инструмента для изучения этиленовой реакции у бактерий. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется влияние этилена, образующегося 2-хлорэтилфосфоновой кислотой (CEPA), на рост бактерий и производство целлюлозы. Этилен активирует сигнальные пути, которые стимулируют синтез целлюлозы, что приводит к усиленному образованию пленки. Эти результаты подчеркивают бактериальную реакцию на этилен.

Протокол

1. Анализы Пелликла
   1. Выращивание и количественное определение заквасок Komagataeibacter xylinus в трех экземплярах:
      1. В трех экземплярах одну колонию Komagataeibacter xylinus инокулируют в 5 мл среды Schramm и Hestrin (SH) (pH 5) с добавлением 0,2% (v/v) стерилизованной фильтром целлюлазы. Инкубируют культуры при 30 °C с перемешиванием при 150 об/мин до достижения оптической плотности при длине волны 600 нм (наружный диаметр₆₀₀) от 0,3 до 0,4 (около 72 часов).
      2. Соберите закваску центрифугированием (2 000 x g; 4 °C; 10 мин). Дважды промойте клетки 5 мл стерильного физиологического раствора и повторно суспендируйте клеточную гранулу. Держите клетки на льду.
      3. Количественное определение ячеек с помощью счетной камеры Петрова-Хауссера.
   2. Приготовьте мастер-смеси для инокуляции 24-луночных планшетов:
      1. Добавьте 60 мл среды SH (pH 7) со 120 мкл запасов 5, 50 и 500 мМ 2-хлорэтилфосфоновой кислоты (CEPA) для получения конечных концентраций CEPA 0,01, 0,1 и 1,0 мМ соответственно. Добавьте еще 60 мл среды SH (pH 7) со 120 μл растворителя, используемого для растворения CEPA. Вихрь перемешать.
      2. Разделите каждую 60 мл среды, содержащей CEPA, на четыре аликвоты по 14 мл. Инокулируют три из 14 мл аликвот биологическими репликатами закваски в концентрации^{10 5} клеток/мл. Держите пробирки с клетками на льду, чтобы предотвратить образование целлюлозы.
         ЗАМЕТКА: Оставшиеся 14 мл аликвоты будут использованы для стерильных контрольных лунок.
   3. Инокулируйте 24-луночные планшеты:
      1. Протестируйте каждую процедуру на отдельной пластине с тремя рядами биологических репликатов и рядом стерильных контрольных препаратов (рис. 1).
      2. Используя мастер-смесь объемом 14 мл, добавьте по 2 мл в каждую из шести лунок стерильного 24-луночного планшета. Полный набор для трех биологических репликатов и стерильного контроля (рис. 1). Повторяйте для каждой процедуры.
      3. Запечатайте пластины парафиновой пленкой и статически инкубируйте в течение 7 дней при температуре 30 °C.
      4. Соберите и измерьте сухой вес пленки (выход целлюлозы) (Рисунок 1):
         1. Самостоятельно переложите пленки в лунки 6-луночной пластины. Чтобы лизировать клетки, обработайте пленки 12 мл 0,1 N гидроксида натрия (NaOH) при температуре 80 °C в течение 20 минут.
         2. Удалите NaOH и нейтрализуйте пленки, промыв ультрачистой водой в течение 24 часов с перемешиванием. Меняйте воду каждые 6 часов.
            ЗАМЕТКА: Пленки должны стать белыми по завершении этапа стирки.
         3. Поместите грузы для пленки на силиконовые коврики и высушите при температуре 50 °C в течение 48 часов до постоянного веса. После высыхания снимите их с ковриков и измерьте их вес на аналитических весах, чтобы определить выход бактериальной целлюлозы.

Результаты

Рисунок 1: Блок-схема, иллюстрирующая протокол, используемый для анализа и анализа пленки. Исходная среда с добавлением CEPA pH 7 SH (60 мл) аликируется для трех отдельных биологических повторных инокуляций и стерильного контроля (по 14 мл каждая). Затем эти культуры алик...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Целлюлаза из Trichoderma reesei ATCC 26921	Сигма	С2730	Водный раствор
Лимонная кислота	БиоШоп	КИТ002.500	Для среды SH
Этефон (≥ 96%; 2-хлорэтилфосфоновая кислота)	Сигма	С0143	Этилен-высвобождающее соединение
Глюкоза	БиоБейсик	ГБ0219	Для среды SH
Komagataeibacter xylinus АТКС 53582	АТКС	53582	Бактериальная целлюлозопродуцирующая альфа-протеобактерия
Фосфат натрия, двухосновной гептагидрат	БиоШоп	СПД579.500	Натрия фосфат, двухосновной гептагидрат для SH среды
NaCl	БиоБейсик	СОД001.1	Хлорид натрия для физиологического раствора и контрольного раствора
Натрия фосфат, одноосновной моногидрат	БиоШоп	СПМ306.500	Фосфат натрия, моноосновной моногидрат для раствора для контроля
НаОХ	БиоШоп	ШЫЙ700.500	Гидроксид натрия для регулировки pH
Парафиновая пленка	Парафильм	РМ996	Для запайки тарелок и колб
Пептон (бактериологический)	БиоШоп	ПЭП403.1	Для среды SH
Счетная камера Петроффа-Хауссера	Научный Хауссер	3900	Камера для подсчета бактериальных клеток
Фильтр для стерилизации полиэфирсульфонов 0,2 мкм	ВВР	28145-501	Для стерилизации целлюлазы
Дрожжевой экстракт	БиоБейсик	Г0961	Для среды SH