Амплификация плазмиды самоубийцы в бактериальном хозяине

Аннотация

Источник: Tomás, J.M., et al. Генерация нулевых мутантов для выяснения роли бактериальных гликозилтрансфераз в бактериальной подвижности. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео показана инициирующая амплификация плазмиды самоубийцы в E. coli. Плазмида, несущая ген устойчивости к антибиотикам, реплицируется только в присутствии белка-инициатора, кодируемого хозяином. После электропорации и инкубации в восстановительной среде смесь наносится на антибиотиксодержащий агар. Бактерии с плазмидой выживают, так как ее инициирующий белок обеспечивает экспрессию гена плазмиды, устойчивого к антибиотикам.

Протокол

1. Генерация нулевых мутантов в генах островка гликозилирования жгутиков

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод мутагенеза основан на аллельном обмене продуктов делеции полимеразной цепной реакции (ПЦР) в кадре с использованием вектора самоубийства pDM428 (GenBank: KC795686.1). Репликация вектора pDM4 зависит от лямбда-пира , а полный аллельный обмен осуществляется за счет использования гена sacB , расположенного на векторе.

1. Конструирование изделий для внутрикадрового делеции ПЦР.
   1. Сконструируйте две пары праймеров, которые амплифицируют участки ДНК до (праймеры A и B) и ниже по течению (праймеры C и D) от выбранного гена или области, подлежащей удалению (рис. 1B).
   2. Убедитесь, что праймеры A и D имеют более 600.о. до и после остановки, соответственно, гена или генов, подлежащих удалению. Эти два праймера должны включать сайт рестрикции на 5'-конце для эндонуклеазы, которая позволяет клонировать pDM4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сайт рестрикции, включенный в 5'-конец праймеров A и D, не должен совпадать с сайтами в ампликонах AB или CD.
   3. Убедитесь, что праймеры В и С находятся внутри удаляемого гена или внутри первого и последнего гена, соответственно, удаляемой области. Убедитесь, что оба праймера (B и C) находятся в кадре и расположены между 5-6 кодонами внутри гена. Кроме того, убедитесь, что оба праймера содержат на 5'-конце комплементарную последовательность 21.о. (табл. 1), которая позволяет соединить ампликоны ДНК AB и CD.
   4. Выращивайте выбранный штамм Aeromonas в 5 мл триптического соевого бульона (TSB) в течение ночи (O/N) при 30 °C. Используйте имеющийся в продаже набор для очистки геномной ДНК и следуйте инструкциям производителя (Таблица материалов). Количественно оцените 2 мкл очищенной ДНК с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте воду двойной дистилляции в качестве заготовки, при этом прибор настроен на запись поглощения при длине волны 260 нм. Запишите поглощение 2 мкл очищенной ДНК 3-5 раз и рассчитайте среднее значение поглощения. Используйте закон Бера-Ламберта для расчета концентрации ДНК, где A = Ɛ.c.l. Где «A» — поглощение, «Ɛ» — средний молярный коэффициент экстинкции ДНК, «c» — концентрация ДНК, а «l» — длина пути (см. инструкции производителя по длине пути каждого прибора).
   5. Используйте 100 нг очищенной хромосомной ДНК в качестве матрицы в двух наборах асимметричных ПЦР с праймерами A-B и C-D (Таблица материалов). Используйте молярное соотношение пар праймеров A:B и D:C в соотношении 10:1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Асимметричная ПЦР позволяет преимущественную амплификацию одной нити матрицы по сравнению с другой.
   6. Проанализируйте продукты ПЦР методом электрофореза в 1% агарозном геле. Используйте TAE (40 мМ трис-ацетат, 1 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)) в качестве буфера для работы геля и установите мощность 8 В/см. Чтобы визуализировать ДНК, добавьте в гель бромид этидия (0,5 мкг/мл) и визуализируйте продукты ПЦР с помощью станции биовизуализации (Таблица материалов).
   7. Вырежьте ампликоны из геля с помощью скальпеля, очистите их в соответствии с протоколом производителя (Таблица материалов) и количественно оцените.
   8. Соедините ампликоны AB и CD с помощью их перекрывающихся последовательностей 21.о. в 3'-конце продуктов ПЦР (рис. 2). Смешайте по 100 нг каждого ампликона (AB и CD) в ПЦР-пробирке с ПЦР-реагентами (pre-AD PCR), но без праймеров, и продлите с помощью программы термоамплификатора. Затем добавьте 100 мкМ праймеров A и D в реакцию (AD PCR) и амплифицируйте как один фрагмент.
   9. Проанализируйте продукт ПЦР (AD amplicon) методом электрофореза в 1% агарозном геле с использованием условий, описанных в шаге 1.1.6, удалите ампликон из геля, очистите его в соответствии с протоколом производителя и количественно определите ампликон (Таблица материалов).
2. Конструирование рекомбинантной плазмиды pDM4 с делецией в кадре.
   1. Выращивание O/N культуры Escherichia coli cc18λ pir , содержащей pDM4, в бульоне Миллера Luria-Bertani (LB) (10 мл) с хлорамфениколом (25 мкг/мл) при 30 °C.
   2. Уменьшите температуру культуры при 5 000 x g при 4 °C и суспензируйте гранулу в 600 μл стерильной дистиллированной воды. Выполняйте экстракцию и очистку плазмиды pDM4 с помощью коммерчески доступного набора для очистки плазмид, следуя инструкциям поставщика (Таблица материалов).
   3. Расщеплять 1 г pDM4 и 400 нг ампликона AD в течение 2 ч с эндонуклеазой, способной расщеплять оба конца ампликона AD и сайт клонирования pDM4 (рис. 2). Следуйте протоколу производителя фермента для условий реакции (Таблица материалов).
   4. Очистите расщепленную плазмиду и ампликон с помощью набора для очистки ДНК и количественно определите их, следуя инструкциям производителя (Таблица материалов).
   5. Для предотвращения религенизации линеаризованной pDM4 удалите фосфатную группу с обоих 5'-концов с помощью фермента щелочной фосфатазы, следуя инструкциям производителя (Таблица материалов). Затем очистите обработанную плазмиду и количественно оцените ее с помощью спектрофотометра, как описано в шаге 1.1.4 (Таблица материалов).
   6. Смешайте 150 нг расщепленного и обработанного фосфатазой щелочного pDM4 с 95-100 нг расщепленного ампликона AD в соотношении вектор:вставка 1:4. Приготовьте реакцию лигирования в объеме 15 μл, следуя инструкциям производителя (Таблица материалов).
   7. Инкубируйте O/N при 20 °C или в выходные дни при 4 °C. После инкубации инактивируйте Т4-лигазу при 70 °C в течение 20 минут.
   8. Используйте лигирование для введения плазмиды в штамм Escherichia coli MC1061λpir методом электропорации. Используйте электрокомпетентные бактерии и кюветы с зазором 2 мм.
3. Получение электрокомпетентной E. coli и электропорация рекомбинантной плазмиды pDM4
   1. Инокулируйте одну колонию штаммаλpir E. coli MC1061 в бульон Миллера Luria-Bertani (LB) и выращивайте O/N при 30 °C с встряхиванием 200 об/мин.
   2. Разведите 2 мл бактериальной культуры в 18 мл бульона LB и инкубируйте при 30 °C с встряхиванием (200 об/мин) до достижения оптической плотности (OD600) в диапазоне 0,4-0,6.
   3. Гранулируйте бактериальную культуру центрифугированием при температуре 5 000 x g и 4 °C в течение 15 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и суспендируйте гранулу в 40 мл охлажденного дистиллированного H₂O.
   4. Повторите этот шаг очистки еще два раза, чтобы удалить все соли культуры. Наконец, суспензируйте гранулу в 4 мл охлажденного дистиллированного H₂O и перенесите по 1 мл суспензии в каждую из четырех конических микропробирок объемом 1,5 мл.
   5. Гранулируйте бактериальную культуру центрифугированием при 14 000 x g и 4 °C в течение 5 минут. Удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы, и суспензируйте каждую гранулу в 100 μл охлажденного дистиллированного H₂O.
   6. Добавьте 3-3,5 мкл смеси для лигирования в каждую пробирку и выдерживайте на льду в течение 5 минут. Затем перенесите содержимое каждой трубки в охлаждаемую электропорационную кювету с зазором 2 мм и приложите напряжение 2 кВ, 129 Ω и постоянную времени около 5 мс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно охладите электропорационные кюветы на льду. Поддерживайте бактерии на льду в течение всей процедуры.
   7. После электропорации добавьте 250 мкл среды SOC (Super Optimal blot with Catabolite Press) в каждую из четырех кювет, чтобы восстановить их содержимое, перенесите их в культуральную пробирку (около 1 мл) и инкубируйте в течение 1 ч при 30 °C с встряхиванием (200 об/мин).
   8. Поместите трансформированные клетки на агаровые пластины Лурии-Бертани (LB) с добавлением хлорамфеникола (25 мкг/мл), чтобы убедиться, что все колонии, растущие на планшете, имеют плазмидный остов.

Таблица 1: Праймеры, используемые для создания нулевых мутантов. Перекрывающиеся области в праймерах B и C выделены. Сайт BamHI выделен жирным шрифтом в буквах A и D.

Название грунтовки	Последовательность в направлении от 5' до 3'	Используется для
А. piscicola AH-3
А-Флги1	CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA	Мутант FGI
Б-Флги1	CCCATCCACTAAACTTAAACAGATCCCGAACTCGAAA
К-Флги12	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGGAACCTTAAATGCCATGA
Д-Флги12	CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
Э-ФЛГИ1	ACCCGCTTCATTCGCTAT
Ф-Флги12	TCCGATTTTCTGACTCAGGG
А-FGI4	CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA	Мутант FGI-4
В-ФГИ4	CCCATCCACTAAACTTAAACACATATTATCTTGCCCCTGAT
С-ФГИ4	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGATGGAGCTAATCACTCGTTT
Д-ФГИ4	CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
Е-FGI4	ATTTCCCTGCCAAATACG
Ф-ФГИ4	CCTGCCAACAGGATGTAAG
Вектор pDM4
pDM4for	AGTGATCTTCCGTCACAGG	Вставки в вектор pDM4
pDM4rev	AAGGTTTAACGG TTGTGGA

Результаты

Рисунок 1: Биоинформатическое обнаружение хромосомных областей и дизайн праймеров. (A) Схема хромосомных областей, идентифицированных у A. hydrophila AH-1 и A. piscicola AH-3. Островок гликозилирования жгутиков A. hydrophila AH-1 является ре...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit	Прикладные биосистемы	4337455	Используется для секвенирования
ДНК-полимераза AccuPrime Taq, высокая точность	Инвитроген	12346-086	Используется для амплификации фрагментов AB, CD и AD
Агароза	Конда-Пронадис	8008	Используется для ДНК-электрофореза
Щелочная фосфатаза, икроножный кишечник (CIAP)	Компания Promega	М1821	Используется для удаления фосфатов на 5'-конце
Бакто-агар	Бектон Дикинсон	214010	Использование для анализа подвижности
БамХИ	Компания Promega	Р6021	Используется для эндонуклеазной рестрикции
BglII	Компания Promega	Р6081	Используется для эндонуклеазной рестрикции
Система BioDoc-IT Imagin	УВП		Станция биовизуализации, используемая для визуализации ДНК
Биотак-полимераза	Биолайн	БИО-21040	Используется для скрининга колоний
Набор для очистки ДНК и гелевой ленты Cytiva illustra GFX PCR и гелевой ленты	Цитивия	28-9034-71	Используется для очистки ампликонов ПЦР и фрагментов ДНК.
ЭДТА	Апплименем	131026.1211	Используется для ДНК-электрофореза
Кюветы для электропорации с зазором 2 мм	ВВР	732-1133	Используется для трансформации
Лурия-Бертани (LB) Агар Миллера	Кондалаб	996	Используется для культуры Escherichia coli
Лурия-Бертани (LB) Бульон Миллера	Кондалаб	1551	Используется для культуры Escherichia coli
Нанокапля ND-1000	НаноДроп Технолоджиес Инк		Спектрофотометр, используемый для количественного определения ДНК
Рифампицин	Апплименем	А2220,0005	Используется для трехродительского спаривания
SOC Средний	Инвитроген	15544034	Используется для восстановления электропорации
Т4 ДНК-лигаза	Инвитроген	15224017	Используется для реакции лигирования
Термоамплификатор Veriti на 96 лунок	Прикладные биосистемы		Используется для реакций ПЦР