Выделение грамотрицательных бактерий с помощью геномных транспозонных вставок

Аннотация

Источник: Kazi, M. I., et al., Generating Transposon Insertion Libraries in gram-negative bacteria for high-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео демонстрируется отбор, количественное определение и сохранение грамотрицательных бактерий-реципиентов, несущих транспозонные вставки, на основе резистентности к канамицину.

Протокол

Генерация финальной библиотеки бактериальных мутантов

1. Разморозьте аликвоту замороженной случки на льду.
2. Сопряжение пластин на 150 мм агаровых пластинах Лурия-Бертани (LB) с добавлением канамицина на основе колониеобразующих единиц (КОЕ), рассчитанных на шаге 3.1. Отрегулируйте объем с помощью LB, чтобы получить 13 333 колоний на 150 μл перед нанесением покрытия.
   ЗАМЕТКА: Количество КОЕ здесь было определено как около 10⁵ КОЕ/мл, поэтому объем спаривания был скорректирован для получения 13 333 колоний на пластину. Это обеспечило бы оптимальное количество колоний на 30 пластинах для библиотеки мутантов с высоким разрешением, не перегружая пластины.
3. Используйте стерильные стеклянные шарики для распределения 150 мкл разведения на пластину с агаром Лурии-Бертани размером 30 x 150 мм с добавлением канамицина, чтобы получить 400 000 колоний (рис. 1C).
   ЗАМЕТКА: Стерильные стержни или любой вид стерильного разбрасывающего инструмента (т.е. стеклянные бусины) могут быть использованы для распространения бактерий на тарелках.
4. Утилизируйте использованную трубку, содержащую излишки сопряжения.
   ЗАМЕТКА: Циклы замораживания/размораживания создают селективное давление на бактериальную культуру, что может исказить результаты эксперимента Tn-seq. Каждый раз используйте свежую аликвоту.
5. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение 14 часов.
   ЗАМЕТКА: Время инкубации оптимизировано, чтобы предотвратить разрастание (соприкосновение колоний). Предлагается свести к минимуму рост за счет сокращения времени инкубации.

Оценка плотности библиотек и объединение в пулы для хранения

1. Подсчитайте КОЕ на каждой пластине, чтобы оценить общее количество мутантов в библиотеке транспозонов. Пересчитайте 20% по крайней мере 3 пластин, чтобы определить оценку количества колоний для всей группы пластин (рисунок 2A). Следите за тем, чтобы колонии не соприкасались с другой колонией.
2. После расчета предполагаемого выхода колонии добавьте 3-5 мл LB (или больше, если это необходимо) на каждую пластину и соскребите бактерии с помощью стерильного скребка. ЗАМЕТКА: Для эффективного соскабливания пластин использовались стерильные инокуляционные петли.
3. Объедините бактериальные суспензии со всех планшетов в конические пробирки объемом 50 мл (рис. 1D). Для этого потребуется несколько конических трубок объемом 50 мл, не менее 3.
4. Гранулы объединенной бактериальной суспензии с использованием центрифугирования при 5000 x g в течение 7 мин.
5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл LB с добавлением 30% глицерина.
6. Аликвот 1 мл библиотеки транспозонов в криовиалы и хранить при -80 °С.

Результаты

Рисунок 1: Схема построения библиотеки транспозонных мутантов. (А) Бактериальная конъюгация. Штамм «донор», который кодирует механизм транспозиции, был смешан со штаммом «реципиент». Смесь обнаруживали на агаровых пластинах Лурии-Бертани (LB) и...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашки Петри 150 мм x 15 мм	Корнинг	351058
Конические стерильные полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 50 мл	Научный центр Фишера	12-565-271
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	АТКС	Н/Д	AmpS, KanS
Кишечная палочка MFD Dap-	Н/Д	Н/Д	DAP Auxotroph, требует 600 мМ экзогенно добавленного DAP для роста. Содержит механизм RP4 для переноса плазмид. Авианосец для JNW68 (36).
Криогенные флаконы с наружной резьбой	Корнинг	09-761-71
Стеклянные бусины	Корнинг	72684
Глицерин	Научный центр Фишера	Г33
Инокуляционные петли	Научный центр Фишера	22-363-602	Инструмент для скребка
Канамицин	Научный центр Фишера	БП906	Используется в концентрации 25 мг/л
Агар LB, Миллер	Научный центр Фишера	БП1425
Бульон LB, Миллер	Научный центр Фишера	БП1426
Фосфатно-солевой буфер, 10X раствор	Научный центр Фишера	BP39920	Разбавленный до 1Х