$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Естественное преображение
ЗАМЕТКА: В качестве реципиента использовалась производная N315, N2-2.1. В этом штамме локус sigH был дублирован таким образом, чтобы конститутивно экспрессировать SigH. Если переносимым маркером резистентности не является хлорамфеникол, для экспрессии SigH можно использовать pRIT-sigH (CmR). В качестве донорской ДНК для трансформации используется очищенная плазмида или экстракт цельной ДНК из cfr-приобретенного S. aureus COL-45.
- Заготовка донорской ДНК
- Культивируйте COL-45 в течение ночи с встряхиванием при 37 °C в колбе объемом 300 мл, содержащей 50 мл триптического соевого бульона (TSB) с добавлением 32 мг/л хлорамфеникола. Культура E. coli HST04, несущая плазмиду pHY300 (TetR), для извлечения плазмиды для контрольного эксперимента.
ЗАМЕТКА: HST04 (dam-/dcm-) не содержит генов ДНК-метилазы. Другие обычные штаммы с ДНК-метилазами также могут быть использованы для получения донора ДНК, поскольку состояние метилирования ДНК не влияет на эффективность трансформации. Альтернативно, плазмида pT181, выделенная из штамма S. aureus COL, также может быть использована в качестве положительного контроля для анализа трансформации. - Соберите клетки центрифугированием (8 000 x g в течение 10 мин при 4 °C).
- Извлеките плазмиды с помощью набора для экстракции плазмидной ДНК или обычного метода очистки ДНК для очистки всей ДНК.
- Количественно оцените очищенную ДНК с помощью спектрометра и поддерживайте ее при температуре 4 °C до использования.
ЗАМЕТКА: Для анализа трансформации используйте свежий препарат ДНК, обычно не старше одной недели. Старые препараты ДНК снижают эффективность трансформации.
- Трансформационный анализ
- Культивируют клетку-реципиента (N2-2,1) в течение ночи в 5 мл TSB при 37 °С с встряхиванием.
- Переложите 0,5 мл ночного посева в пробирку объемом 1,5 мл. Осаждение клеток методом центрифугирования (10 000 x g в течение 1 мин при 4 °C).
- Суспензируйте клетки с 10 мл среды CS2 в пробирке объемом 50 мл.
ЗАМЕТКА: Среда CS2 представляет собой полноценную синтетическую среду, которая обуславливает способность к естественному преобразованию в S. aureus. Другие стандартные лабораторные среды, такие как TSB или инфузия сердца мозга (BHI), не подходят для трансформации. - Выращивайте бактерии при температуре 37 °C с встряхиванием (180 об/мин) до поздней экспоненциальной фазы (около 8 часов).
- Соберите клетки центрифугированием (5 000 x g в течение 5 мин при 4 °C).
- Ресуспендируйте клетки в 10 мл свежей среды CS2.
- Добавьте в клеточную суспензию 10 мкг очищенной плазмиды или геномной ДНК (шаг 1.1.4). Встряхивайте при 37 °C и 180 об/мин в течение 2,5 часов.
ЗАМЕТКА: Более короткое время инкубации с ДНК (<2,5 часа) приводит к более низкой частоте трансформации. - Соберите клетки центрифугированием (5 000 x g в течение 5 мин при 4 °C).
- Ресуспендируйте клетки в 10 мл среды BHI. Смешайте клеточную суспензию с 90 мл расплавленного агара BHI (55 °C) с 32 мг/л хлорамфеникола (или 5 мг/л тетрациклина в контрольном эксперименте). Вылейте смесь в чашки Петри толщиной 90 мм. Быстро остудите и дайте агару застыть.
- Инкубируйте пластины при температуре 37 °C в течение 2 суток.
- Реплицируйте сгенерированные колонии (трансформанты) путем переноса колоний (с помощью зубочисток) в новые агаровые пластины BHI, содержащие соответствующие антибиотики, для подтверждения их характеристик устойчивости. Подтвердите приобретенный ген резистентности (cfr или tetM) с помощью ПЦР колоний.