В этом видео демонстрируется высокопроизводительный метод скрининга с использованием Caenorhabditis elegans для изучения нокдаунов генов во время взаимодействия хозяина и патогена. В нем описана процедура подготовки нокдаун-червей и переноса их на пробирные планшеты для оценки эффектов индуцированного патогенами уничтожения червей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Многолуночный анализ на жидкостной основе для скрининга нокдаунов C. elegans
455 просмотров
⸱
26 сентября 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
1. Адаптация для скрининга множественных штаммов или нокдаунов Caenorhabditis elegans (настройка скрининга рибонуклеиновой интерференции (РНК-интерференции))
Заметка: Это экран РНК-интерференции, описанный для 24-луночного планшета.
- Добавьте 1 мл S базала в лунку 24-луночного планшета, содержащего червей, засеянных РНК-интерференцией. Осторожно взбалтывайте червей, встряхивая пластину, затем переложите червей в пустую, стерильную 24 глубоколуночную пластину. Дайте червям осесть гравитационно (~5 минут).
- Аспират надосадочная жидкость, оставляя примерно 1 мл. Добавьте в каждую лунку по 7 мл S базала.
- Повторите шаги 1.1 - 1.2 минимум еще 2 раза. После окончательной промывки аспирируйте надосадочную жидкость, оставив примерно 400 μл.
- Используя функцию Resampler сортировщика червячков, отсортируйте 22 червя из 24-луночной пластинчатой червячной суспензии в каждую лунку 384-луночного планшета (каждая лунка 24-луночного планшета дает 8 - 12 лунок из 384-луночного планшета).
- Чтобы избежать голодания, перед сортировкой пипетируйте бактерии в 384-луночные планшеты (либо штамм, который служит исключительно пищей, например, OP50, либо патогенный штамм).
- После того, как черви были отсортированы в 384-луночный планшет, добавьте небольшие молекулы или другие материалы, специфичные для эксперимента.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Биосортировщик COPAS FP | Union Biometrica | Проточный цитометр для больших объектов/сортировщик червей | |
| 24 Блок RB с глубокими скважинами | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
| 384-луночный планшет | Greiner Bio-One | МПГ-781091 | |
| Питательная среда для нематод (NGM) | Количество на литр: 18 грамм агара, 3 грамма NaCl, 2,5 грамма пептона, 1 мл хлорида кальция (1 М), 1 мл сульфата магния (1 М), 25 мл фосфатного буфера и 973 мл воды милли-Q | ||
| S базальный | Количество на литр: 5,85 грамма NaCl, 6 грамм одноосновного фосфата калия, 1 грамм двухосновного фосфата калия и 1 литр воды milli-Q | ||
| Агар | USBиология Медико-биологические науки | А0930 | |
| NaCl | USBиология Медико-биологические науки | С5000 | |
| Пептон | USBиология Медико-биологические науки | П3300 | |
| Хлорид кальция | USBиология Медико-биологические науки | ||
| Сульфат магния | Научный центр Фишера | М63-500 | |
| Фоспатный буфер | Количество на литр: 132 мл двухосновного фосфата калия (1М) и 868 мл моноосновного фосфата калия (1М) | ||
| Одноосновной фосфат калия | Акрос Органик | 7778-77-0 | |
| Двухосновной фосфат калия | USBиология Медико-биологические науки | П5100 | |
| Штаммы бактерий | |||
| P. aeruginosa (PA14) | |||
| Суперфуд кишечной палочки (OP50) | |||
| РНК-интерференция бактерий E. coli (HT115) | |||
| Штамм червей | |||
| glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064) |
